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MEKK1 – JNK 丝裂原活化激酶（MAPK）级联模块在多房棘球绦虫干细胞中具有活性-厦门

来源：时间：2021-12-10 09:30:37

MEKK1 – JNK 丝裂原活化激酶（MAPK）级联模块在多房棘球绦虫干细胞中具有活性-厦门杂志期刊论文发表

· 克里斯汀•斯托尔，
· 莫妮卡·伯格曼，
· 马库斯·斯皮利奥蒂斯，
· 克劳斯·布雷姆
· 出版日期： 2021年12月08日

抽象

背景

狐绦虫多房棘球绦虫的变质期幼虫通过中间宿主肝脏内的肿瘤样生长引起肺泡棘球蚴病。Metacestode的生长发育由宿主来源的细胞因子（如胰岛素，成纤维细胞生长因子和表皮生长因子）通过激活寄生虫表达的同源受体酪氨酸激酶来刺激。然而，关于信号传递到寄生虫核以及与其他寄生虫信号系统的交叉反应知之甚少。

方法/主要调查结果

使用生物信息学方法，克隆和酵母双杂交分析，我们确定了一种新型丝裂原活化激酶（MAPK）级联模块，该模块由E组成。酪氨酸激酶受体相互作用物生长因子受体结合2，EmGrb2，MAPK激酶激酶EmMEKK1，新型MAPK激酶EmMKK3的多位素同源物，以及与c-Jun N末端激酶（JNK），EmMPK3的紧密同源物。全坐骑原位杂交分析表明，EmMEKK1和EmMPK3均以E表示。多房生发（干细胞）细胞，但也在分化或分化细胞中。用已知的JNK抑制剂SP600125治疗导致干细胞中偏孢子囊泡的形成显着减少，并且成熟变质子囊泡中增殖干细胞的特异性减少。

结论/意义

我们为MEKK1-JNK MAPK级联模块的表达提供了证据，该模块在哺乳动物中与E中的应激反应，细胞骨架重排和细胞凋亡至关重要。多房干细胞。抑制剂研究表明，JNK信号传导在E中起重要作用。多房干细胞存活和/或维持。我们的数据与分子和细胞研究相关的串扰信号传导机制，这些机制控制棘球绦虫干细胞功能，并引入JNK信号级联作为针对棘球蚴病的化疗药物的可能靶标。

作者简介

绦虫E的变质虫幼虫。多房性像恶性肿瘤一样在宿主的肝脏内浸润，从而导致致命的肺泡棘球蚴病。先前的工作确定，metacestode通过表达与各自宿主受体共享高同源性的表面受体来感知宿主激素和细胞因子的信号。然而，人们知之甚少的是，这些信号是如何从寄生虫细胞表面传递到细胞核以改变基因表达的。在这项工作中，作者提出了几种蛋白激酶的模块，这些蛋白激酶通常将细胞因子信号从表面受体传递到称为丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）的中枢调节因子。作者证明，该模块在寄生虫干细胞中具有活性，其驱动变质虫幼虫的发育。他们还表明，针对模块的一种组分EmMPK3的抑制剂会影响偏孢子中干细胞的维持和/或存活，并阻止寄生虫细胞培养物形成变质虫幼虫。这些信息有助于分子和细胞研究，以解开调节棘球绦虫干细胞增殖以响应宿主信号的复杂信号网络。此外，这些数据可以通过引入EmMPK3作为可能的药物靶点来开辟抗寄生虫化疗的新途径。

数字

引文：Stoll K，Bergmann M，Spiliotis M，Brehm K（2021）A MEKK1 - JNK丝裂原活化激酶（MAPK）级联模块在棘球绦虫干细胞中具有活性。PLoS Negl Trop Dis 15（12）：e0010027。https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010027
编辑器：Michael J. Smout，詹姆斯库克大学热带健康与医学系，澳大利亚
收到：八月 13， 2021;接受：十一月 25， 2021;发表：十二月 8， 2021
版权所有：© 2021 Stoll et al.这是一篇根据知识共享署名许可协议条款分发的开放获取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。
数据可用性：所有相关数据均在稿件及其支持信息文件中。
资金：这项工作得到了惠康信托基金会（https://wellcome.ac.uk/），107475/Z/15/Z（FUGI）和巴伐利亚基金会（https://www.forschungsstiftung.de/）（AZ-1341-18）（均给KB）的资助。KS得到了维尔茨堡大学医学院的资助（GSLS /KS/270194;https://www.med.uni-wuerzburg.de/startseite/）。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
相互竞争的利益：作者宣布不存在相互竞争的利益。

介绍

狐绦虫E的变质虫幼虫阶段。多灶性是肺泡棘球蚴病（AE）的致病因子，AE是一种在北半球流行的致命性人畜共患病[1]。在中间宿主的感染期间，寄生虫经历了几次发育转变，这些转变是由多能干细胞群驱动的，称为"发芽细胞"（GC）[2，3]。少量未分化的GC作为存在于感染性卵中的盘层幼虫的一部分被输送到宿主中，这些幼虫由最终宿主释放并由中间宿主口服。在肠道孵化并穿透肠壁后，盘层进入宿主肝脏，其中GC驱动变质样向变质期过渡，这是充满液体的囊泡的网状物，像恶性肿瘤一样浸润生长到周围的宿主组织中[3，4]。寄生虫增殖完全由GC驱动，GC是扁虫干细胞的典型特征，是寄生虫中唯一有丝分裂活性的细胞，并产生所有分化的细胞（例如肌肉，神经，糖原/脂质储存细胞）[2]。值得注意的是，从盘层形成结构上不寻常的变质期是通过改变寄生虫的体轴来实现的，使得放弃了盘层的前后体轴并转变为偏心球层的完全后部组织[5]。在天然中间宿主（啮齿动物）感染结束时，当GC产生育雏囊时，前后体轴重新建立，这些囊最终形成原始擦挤体[5]，这是头部状结构，当它捕获猎物时传递给最终宿主。另一方面，在人类感染中，很少产生原擦伤层[6]。一般来说，人类AE很难治疗，针对寄生虫β微管蛋白的化疗必须长时间（有时是终身的）并且与不良副作用相关[7]。
近年来，我们已经确定胰岛素和成纤维细胞生长因子（FGF）家族的宿主激素和细胞因子刺激GC的变质沉积发育以及成熟变脑袋的GC增殖和生长[8，9]。此外，Cheng等人[10]证明人表皮生长因子（EGF）刺激成熟偏心胚泡中的GC增殖。我们报道了E中胰岛素，FGF和EGF家族的受体酪氨酸激酶（RTK）的存在。多位体，在上述所有病例中，寄生虫RTKs通过同源宿主激素直接激活已被证明[8–12]。因此，虽然有一些关于宿主细胞因子与寄生虫受体相互作用的信息，但目前对这些信号如何传递到细胞核以改变基因表达模式知之甚少。在RTK的情况下，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联模块的组分是重要的下游信号传导因子。在这些模块中，Erk-，p38-和JNK亚家族的MAPK通常由上游MAPK激酶（MAPKK）激活，MAPKK激酶本身由上游MAPKK激酶（MAPKKK）和MAPKKK激酶调节[13]。一旦被上游激酶激活，Erk-，p38-和JNK MAPKs最终会磷酸化，从而激活转录因子，例如c-Jun或c-Fos，然后易位到细胞核并调节特异性基因表达[13]。在以前的研究中，我们已经表征了E中的几种化合物。其中三个，Erk样MAPK EmMPK1，MAPKK EmMKK2和MAPKKK EmRaf形成了一个MAPK级联模块，通过酵母双杂交分析评估[14–16]。我们还证明了E.多房p38样MAPK EmMPK2是一种本构活性激酶，其作用独立于MAPKKs的上游激活[17]。关于MAPKs的第三个分支，即激活JNK的c-Jun，到目前为止还没有在E中进行过研究。多房 .
传统上，JNK途径已经在应激反应的背景下进行了研究，但同时也被称为参与各种过程，如细胞骨架重排或细胞凋亡[18]。JNKs被不同的上游受体激活，例如GPCR家族的成员（G蛋白偶联受体），TNF-α受体和几种RTK[18]。导致JNK激活的最佳研究途径之一涉及在刺激上游EGF受体后将MAPKKK MEKK1与JNK直接结合，使用Grb2（生长因子受体结合2）作为EGF受体和MEKK1之间的适配器分子[18–22]。有趣的是，在与cestodes密切相关但非寄生的亲戚的自由生活计划学家中，MEKK1和JNK的直系同源物都参与体轴形成和干细胞（neoblast）维持的过程[23–26]。鉴于E.多房变质虫是改变体轴形成的结果[5]，并且新胚细胞样干细胞是棘球绦虫幼虫增殖的核心[2]，这促使我们更接近地表征寄生虫幼虫中MAPK信号传导的这一特定分支。我们在这里报告，MEKK1和JNK的近似同源物都以E表示。多位干细胞和功能相互作用的方式类似于哺乳动物的对应物。我们还报告了JNK的已知和特异性抑制剂SP600125的抗寄生虫作用。-厦门杂志期刊论文发表

方法

道德声明

寄生虫材料的体内繁殖是在蒙古jirds（Merionesunguiculatus）中进行的，这些jirds在维尔茨堡大学卫生和微生物研究所的当地动物设施中饲养和饲养。本研究严格按照德国（Deutsches Tierschutzgesetz，TierSchG，2010年12月9日的版本）和欧洲（欧洲指令2010/63 / EU）关于动物保护的规定进行。该协议由下弗兰肯州政府道德委员会（Regierung von Unterfranken）批准，许可证号为55.2-2531.01-61/13。

生物体和培养方法

所有实验均使用E进行。多房猴分离出H95、GH09、英格丽德和J2012[27]，它们要么来自德国施瓦本山脉地区自然感染的狐狸（H95）[28]，要么来自在繁殖圈中自然感染的旧世界猴子物种（Macaca fascicularis）（GH09，英格丽德，J2012）[29]。这些分离株在蒙古语jirds（Meriones unguiculatus）中连续通过，基本上如前所述[30]。在长时间腹膜排出期间，E。多房间孢子组织逐渐失去形成育雏囊和原造回囊的能力[30]，并且在这些实验时，分离株J2012（从2012年开始）仍在产生原鞘膜，尽管与新鲜分离株相比显着减少，而H95（1985），GH09和Ingrid（均来自2009年）不再在体内或体外开发育雏囊。寄生虫变质囊泡在轴心条件下的体外培养如前所述[30，31]，原代寄生虫细胞培养物的分离和维持基本上按照Spiliotis等人的建立进行[32，33]。在所有情况下，介质每三天更换一次（d）。对于抑制剂研究，将特定浓度的SP600125（德国慕尼黑Seleckchem）溶解为100mM储备溶液并储存在-80°C下，按照指示加入寄生虫培养物中，并使用阴性对照DMSO（0.1%）。

核酸分离、克隆和测序

如前所述，使用基于Trizol（5Prime，德国汉堡）的方法从体外培养的轴突间孢子囊泡和原代细胞中分离RNA[8]。对于逆转录，使用寡核苷酸CD3-RT（5'-ATC TCT TGA AAG GAT CCT GCA GGT26V-3').使用PCR克隆试剂盒（德国希尔登QIAGEN）或TOPO XL克隆试剂盒（Invitrogen）克隆PCR产品。用于emmekk1 、emgrb2、emmkk3、emmkk4、emmkk5和emmpk3 cDNA 扩增和表征的引物序列的完整列表在S1 表中给出。感兴趣的基因的鉴定将结合下面的结果进行讨论。克隆后，使用引物与Sanger测序（Microsynth Seqlab，哥廷根，德国）与多个克隆位点附近的载体序列结合，直接对PCR产物进行测序。这项工作中新表征的所有基因的序列已提交到GenBank，EMBL和DDJB数据库，其加入编号列于S1表中。

原位杂交和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记

根据制造商的说明，使用DIG RNA标记试剂盒（罗氏）用T7和SP6聚合酶（新英格兰生物实验室）通过体外转录合成Digoxygenin（DIG）标记的探针-和emmpk3-cDNA片段克隆到载体pJET1.2（赛默飞世尔科技）。用于探针生产的引物列在S1表中。随后使用RNEasy Mini试剂盒（Qiagen）纯化探针，通过电泳进行分析，并通过用DIG标记的对照RNA（Roche）进行点印迹连续稀释来定量。随后在体外培养的偏孢子囊泡上进行全安装原位杂交（WISH），基本上如前所述[2，5]，使用直径至少1cm的囊泡以避免在洗涤步骤中丢失材料。使用尼康A1共聚焦显微镜对荧光标本进行成像，并使用ImageJ创建最大投影，如前所述[5]。在所有情况下，阴性对照检测探头均未产生染色结果。使用50μM EdU进行体外标记5小时（h），并在WMISH之后使用Alexa Fluor 555叠氮化物进行荧光检测，基本上如前所述[2]。

酵母二杂交（Y2H）分析

基于Gal4的Matchmaker系统（Clontech）被Zavala-Góngora等人描述[34]使用。E的编码序列。如前所述，通过PCR从通过逆转录来自元胸囊泡，原造血细胞和原代细胞的RNA获得的cDNA池中扩增多位点基因[5]。在大多数情况下，完整的编码序列被扩增，除了emmekk1的情况，其中编码蛋白质的N端和C端部分的区域必须单独克隆。用于扩增所有cDNA的引物在S1表中提供，并包括用于克隆成质粒pGADT7（用于与GAL4激活结构域，AD）和pGBKT7（用于与GAL4 DNA结合结构域，BD融合）的适当限制性内切酶的适配器位点。对于这项工作中分析的几个基因，Y2H融合载体以前由我们生成，并在[14]（emraf），[35]（axin1，axin2）和[16]（emmkk1，emmkk2）中进行了描述。
将pGADT7-和pGBKT7-融合质粒共转化为酵母菌株AH109，并在亮氨酸/色氨酸缺乏的最小培养基板上生长。孵育三天后，选择阳性转化子（每种组合三个独立的克隆），并在缺乏亮氨酸，色氨酸（生长控制），组氨酸（中等严格性）或组氨酸和腺嘌呤（高严格性）的最小介质板上在30°C下再进行三天的相互作用分析。T-抗原-pGADT7与p53-pGBKT7的共转化子为阳性对照，T抗原-pGADT7和lamC-pGBKT7的共转化子为阴性对照。在自身活化的情况下，由融合蛋白与空载体对照物共转化后的集落生长指示，另外在缺乏亮氨酸，色氨酸和组氨酸的最小培养基上进行相互作用研究，并在30°C下用1-25mM 3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）进行一周。

RT-qPCR对羟基脲（HU）-和Bi2536处理的偏孢子囊泡

分离株Ingrid的Metacestode囊泡在轴心条件下体外培养7 d，基本上如前所述[2]，然后用40mM HU[2]或100nM的Polo样激酶抑制剂Bi 2536[36]处理另外7天，以特异性消除发芽细胞群（培养基变化和抑制剂添加每2天）。从抑制剂处理的囊泡和对照囊泡中分离总RNA（与DMSO孵育），并如前所述进行cDNA合成[37]。在StepOne Plus循环仪（应用生物系统公司，美国）中使用5 x HOT FIRE-Pol EvaGreen qPCR混合物加2.4μl（1x），每个引物的0.72μl（300nM），6.96μlDNase游离水和cDNA的PCR混合物进行qPCR。循环条件为：95°C下15分钟，然后是40x（95°C时15秒，60°C时20秒，72°C时20秒）。在72°C下进行数据收集。如前所述，使用组成性表达的基因elp（EmuJ_000485800）进行归一化[37]。引物的引物序列，扩增子大小和PCR效率值在S1表中描述。

抑制剂研究

抑制剂研究根据先前建立的方案在成熟的变质囊泡和原代细胞培养物上进行[8，9，17，36]。按照[30]中所述建立成熟的变质菌培养物，直到当以1至25μM的浓度加入抑制剂SP600125（Selleckchem）时，它们达到约5mm的囊泡大小（DMSO中的储备溶液100mM）。更换培养基，每3 d加入新的抑制剂，孵育长达13 d。在阴性对照中，仅添加了DMSO。每天通过光学显微镜监测囊泡的结构完整性。在第13天，加入不含抑制剂的新培养基，并将囊泡恢复3小时，然后基本上按照先前所述进行5小时EdU掺入脉冲[36]。制备原代细胞培养物如前所述[30]，每3天更换一次培养基并加入抑制剂SP600125，最多19 d。完全成熟的变质囊泡的形成基本上是如前所述[9，36]在显微镜下监测的。所有实验均采用三份生物一式三份和三份技术三份进行，每个元细胞或原代细胞培养物。

计算机分析和统计

使用 BLASTP 对 nr-aa 和 SWISSPROT 数据库集合（https://www.genome.jp/）下可用的 nr-aa 和 SWISSPROT 数据库集合进行氨基酸比较。针对E的基因组分析和 BLAST 搜索。多位基因组[27]是使用资源（https://parasite.wormbase.org/index.html）完成的。使用应用BLOSUM62矩阵的MegAlign软件（DNASTAR版本12.0.0）生成CLUSTAL W比对。域预测是使用（http://smart.embl-heidelberg.de/）下提供的简单模块化架构研究工具（SMART）以及（https://prosite.expasy.org/scanprosite/）下可用的PROSITE扫描进行的。进行双尾，未配对的学生T检验以进行统计分析（GraphPad Prism，版本4）。误差线表示均值的标准误差。对于低于0.05的p值（用*表示），差异被认为是显着的。

结果

E的克隆和表征。multilocularis mekk1 ortholog

由于其在哺乳动物的MAPK级联信号传导中的核心作用及其在平面动物体轴测定中的功能，我们有兴趣鉴定和克隆E的mekk1同源物。多房 .为此，我们首先挖掘了可用的E。多位基因组信息[27]通过BLASTP分析，使用人类MEKK1作为查询，并产生由位点编码的蛋白质EmuJ_000389600（注释为MAPKKK）。接下来，我们在类似的BLASTP分析中使用了先前描述的平面MEKK1蛋白[26]，并且再次获得EmuJ_000389600作为编码具有最高相似性的蛋白质的基因。由E.然后，我们设计了多位基因组序列，以克隆和测序来自变质孢子mRNA制剂的全长EmuJ_000389600 cDNA，从而验证了WormBase寄生虫中描述的注释版本。
EmuJ_000389600位点由13个外显子和12个内含子组成，其中两个是位于转录起始位点和平译起始密码子之间的5'内含子。全长成绩单包括5.047 kb，5'UTR为281 bp，3'UTR为377 bp。开放的阅读框包含4.386 kb（不包括终止密码子），编码1，462个氨基酸的蛋白质。MEKK1因子的标志是蛋白激酶结构域和所谓的RING基序，其类似于Zink手指，至少在哺乳动物中充当泛素连接酶，介导靶蛋白的降解[38]。因此，通过在计算机蛋白质结构域分析中，我们鉴定了EmuJ_000389600产物的残基1096和1363之间的蛋白质激酶结构域以及残基339和402之间的推定RING基序（图1）。最后，当我们使用EmuJ_000389600推断的氨基酸序列作为对SWISSPPROT数据库的相互BLASP搜索的查询时，我们发现哺乳动物MEKK1同源物的最高同源性（例如，激酶结构域中与人类MEKK1的52%相同和72%相似的残基）。同样，在对平面MEKK1的相互BLASP分析中发现了最高的同源性（图1）。综上所述，基于EmuJ_000389600编码的蛋白质的结构域结构，其中包含MEKK1激酶的所有标志以及该蛋白质与人类和平面MEKK1同源物的同源性，我们得出结论，我们已经成功克隆了E。multilocularis mekk1 locus.因此，我们将基因命名为emmekk1（用于E。多房性MEKK1）和各自的蛋白质EmMEKK1。图 1.EmMEKK1的序列特征。
（A） EmMEKK1 域结构。蓝色显示的是RING结构域（R）和丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（S / TKD）的位置。（B）E的不同MEKK1同源物的RING结构域的氨基酸序列比对。multilocularis （EmMEKK1; this work）， Dugesia japonica （DjMEKK1;DDBJ/EMBL/GenBank 加入编号：BBA10910）和H。智人（HsMEKK1;Q13233）。完美对齐的站点（*）以及强组（;)或弱（.）相似性在对齐下方标记。RING zink手指的高度保守的半胱氨酸残基另外在对齐上方用点标记。（C）不同MEKK1同源物的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域的氨基酸序列比对。序列起源和装饰如（B）所示。-厦门杂志期刊论文发表

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010027.g001

emmekk1在E中的表达式。多房干细胞

根据在E期间产生的转录组分析。多位细胞全基因组计划[27]，与元胸囊泡相比，emmekk1在孵育2或7 d后在原代细胞培养物中显示出更高的表达（S1图）。由于这些培养物在GC[2]中高度富集，我们假设emmekk1可能在这种细胞类型中显示出显性表达。为了进一步研究这一方面，我们对间孢子囊泡进行了RT-qPCR分析，其中GC群体在用抑制剂HU和Bi 2536处理7天后已经耗尽。正如我们之前已经证明的那样，两种抑制剂都特异性地消除了元胸囊泡中的干细胞，否则这些干细胞在结构上保持完整[2，36]。如图S3所示，与本构表达的对照基因elp[37]相比，emmekk1在HU处理的囊泡中的表达降低至~40%，在Bi 2536治疗的囊泡中降至~60%，进一步表明该基因在GC群体中的表达。为了澄清这种情况，我们对与EdU一起孵育的变脑孢子囊泡进行了WISH分析，从而鉴定了增殖的干细胞室[2]。如图2所示，在两个不同E的变质囊泡中。multilocularis分离了我们在EdU +和EdU-细胞中检测到的emmekk1信号。在5小时EdU脉冲期间，两个E的变质囊泡。multilocularis分离出的Ingrid和J2012显示出略有不同的EdU +细胞百分比（Ingrid为4.3 +/- 2.4%，n = 1712;J2012为8.5 +/- 2.9%，n = 2019）和emmekk1+细胞（Ingrid为8.6 +/- 3.6%，n-1712;J2012为13.6 +/- 4.8%，n = 2019）。另一方面，在两种分离株中，所有EdU+/emmekk1+的共定位值约为69%（Ingrid为69.2 +/- 14，2%，n = 162;J2012为68.8 +/- 23.2%，n = 70）。参考所有emmekk1+ 单元，J2012 的共定位值（45.0 +/- 16.0%， n = 269）略高于 Ingrid （33.5 +/- 13.8%， n = 142）。因此，虽然在两种分离株中，大约三分之二的干细胞也表达了emmekk1，但J2012中Emmekk1+细胞在S期的比例略高于Ingrid（尽管没有统计学意义）。不同分离株的元孢子囊泡中EdU +细胞数量的差异可能是由于培养基中的EdU与囊泡内大量包虫液之间的缓慢平衡而导致的囊泡大小的差异[2]。由于分离株Ingrid在体外培养的同一时间内通常产生比J2012更大的囊泡，这可以解释观察到的EdU +细胞数量的微小差异。然而，在这两种情况下，我们检测到相当数量的EdU +细胞对emmekk1染色呈阳性，表明GC中emmekk1的表达并不是只有一个分离株的特殊性状。综上所述，这些分析表明emmekk1在E的大多数中表示。多房干细胞，但也在一定数量的有丝分裂后细胞中。
图 2.emmekk1在元囊泡中的表达。
A）在囊泡萌发层上的愿望。从左到右依次显示：核DAPI染色（蓝色），EdU检测（红色），emmekk1 WISH（绿色）以及所有通道的合并。全三角形表示对 EdU 和emmekk1-探针进行双重染色的细胞，开口三角形表示仅 EdU+，箭头表示单独使用 emmekk1+ 。条形表示 20 μm。B） WISH结果摘要。隔离物英格丽德（上图）和 J2012（下图）的值以百分比为单位给出。颜色代码如下所示。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010027.g002

EmMEKK1的上游互动合作伙伴

接下来，我们有兴趣确定EmMEKK1的细胞内相互作用伙伴，并且与之前关于E的几项研究一样。多位点信号转导系统[14，16，34，35，39，40]，采用Y2H系统来测量蛋白质 - 蛋白质相互作用。由于多次尝试将emmekk1 cDNA全长克隆为AD和BD-载体失败，我们决定将读取帧作为两部分进行克隆。质粒 pGADT7-5'mekk1 和 pGBDT7-5'mekk1 分别编码 GAL4 AD 或 BD 的融合蛋白，与 EmMEKK1 的氨基酸 5 至 803 （pGADT7-5'mekk1）或 EmMEKK1 的氨基酸 5 至 790 （pGBDT7-5'mekk1）融合蛋白。因此，这些质粒包含RING结构域的编码区域，但排除了TKD。通过质粒pGADT7-3'mekk1和pGBDT7-3'mekk1，向EmMEKK1的C端表达具有氨基酸729编码区的AD和BD融合蛋白。因此，它们包含TKD的编码信息，但排除了RING域。
作为哺乳动物MEKK1最重要的相互作用伙伴之一，生长因子受体结合蛋白2（Grb2）先前已被鉴定并显示可介导与活化的EGF受体的联系[21]。由于到目前为止还没有在cestodes中描述编码Grb2同源物的基因，因此我们使用人类Grb2氨基酸序列并挖掘了可用的E。通过 BLASTP 和互惠 BLASTP 搜索的多位基因组信息。这些分析表明，E.multilocularis基因组仅包含一个相应的基因（EmuJ_000587600），该基因编码具有预期结构域结构（SH3-SH2-SH3）的蛋白质，与人类Grb2具有明确的同源性（52%相同，72%相似残基）。因此，我们将这个基因命名为emgrb2，编码蛋白质EmGrb2（图3）。转录组分析[27]表明，emgrb2在整个生命周期中表达（S1图）。
图 3.EmMEKK1的上游互动合作伙伴。
A） Y2H与推定的上游交互伙伴的交互实验总结.EmMEKK1的N端和C端区域在左侧表示为分别包含RING和丝氨酸/苏氨酸激酶结构域的区域，如图所示融合到Gal4-AD或Gal4-BD。本研究中测试的可能的相互作用伙伴在上面显示为AD和BD融合。空矢量控件用"e"标记。未指示交互作用（-）或高严格条件（+++）下的交互作用。nd = 未确定。B）Y2H实验显示了EmMEKK1和EmGrb2之间的相互作用。左板，用于转染控制的SD-Leu-Trp;右板，SD-Leu-Trp-His-Ade，用于高严格相互作用。1，阳性对照（T-抗原-AD x p53-BD;2，阴性对照（T-抗原-AD x lamC-BD）;3，MEKK1-3'-AD x 空BD;4，MEKK1-5'-AD x空BD;5，EmBrb2-AD x空BD;6，EmGrb2-AD x MEKK1-3'-BD;7，EmGrb2-AD x MEKK1-5'-BD.C）EmGrb2（上图）和人Grb2（HsGrb2）之间的氨基酸序列比对。相同的残基用"*"标记，生化相似的残基用"："标记。SH3 域以蓝色表示，SH2 域以红色表示。-厦门杂志期刊论文发表
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010027.g003
哺乳动物MEKK1的已知相互作用伙伴还包括癌症相关的MAPKKK c-Raf[40]和肌毒素，它们参与wnt信号通路[41，42]。我们已经对各自的同源物进行了表征[14，35]，因此被纳入分析中，作为质粒pGADT7-emraf / pGBDT7-emraf（EmRaf，EmuJ_001079900），pGADT-7-ax1 / pGBDT7-ax1（axin 1，EmuJ_000624800）和pGADT7-ax2 / pGBDT7-ax2（axin 2，EmuJ_001141200）。
如图3所示，我们无法检测到EmMEKK1和EmRaf之间以及EmMEKK1或两个棘球绦虫轴蛋白中的任何一个之间的相互作用，至少在Y2H系统中是这样。另一方面，对于EmMEKK1和EmGrb2，在EmGrb2-AD x 5'-MEKK1-BD以及EmGrb2-AD x 3'-MEKK1-BD的组合中观察到相互作用。不幸的是，当EmGrb2融合到Gal4 BD并针对空AD载体进行测试时，我们已经观察到酵母在低严格条件下的生长，因此只能分析与EmGrb2融合到AD的组合。然而，由于相互作用是在高严格条件（15 mM 3-AT）下观察到的，这些分析表明EmMEKK1充当EmGrb2下游的信号传感器。

EmMEKK1下游互动合作伙伴

MAPKKK的典型下游交互伙伴是双特异性MAPKK，我们之前在E中已经描述了其中的两个。多房 [ 16]。虽然这两个MAPK，EmMKK1和EmMKK2，都作为Y2H分析的上游伙伴与EmRaf相互作用，但只有EMMKK2与类似Erk的MAPK EmMPK1[16]相互作用。要标识在E中编码的完整 MAPKK 集。多位基因组，我们再次使用全套人类MAPKK作为查询进行BLASTP和互惠BLASTP搜索。通过这些分析，我们确定了另外三个编码双特异性MAPKK的基因，并根据既定的命名法emmkk3 / EmMKK3（EmuJ_000123600），emmkk4/ EmMKK4（EmuJ_000221400）和emmkk5/ EmMKK5（EmuJ_001114500）指定了基因和蛋白质。如图4所示，系统发育分析表明，EmMKK3和EMMKK5与人类MKK7和MKK4（均为JNK分支），EmMKK2与人类MEK1/ MEK2（Erk1 / 2分支）之间的同源性接近，EmMKK4和EMMKK1与Erk分支的人类MKK之间存在较远的相关性。没有棘球绦虫MAPKK显示出与p38分支的人类同源物的接近同源性。根据现有的转录组数据[27]，所有五个MKK编码基因均以E表达。与元胸科相比，多房幼虫阶段的emmekk1、emmekk4和emmekk5在原鞘翅目中的表达水平略高（S1图）。
图 4.EmMEKK1 和 EmMKK3 之间的相互作用。
A）棘球绦虫MAPKK（如本工作所述）和人类MAPKK的系统发育树。使用E的全长氨基酸序列进行CLUSTALW比对。多房性EmMKK1 （加入编号.FN434110）、EmMKK2 （FN434111）、EmMKK3 （MW358635）、EmMKK4 （MW358636）和 EmMKK5 （MW358637）以及人类（Hs） MKK1 （Q02750）、MKK2 （P36507）、MKK3 （P46734）、MKK4 （P45985）、MKK5 （Q13163）、MKK6 （P52564）和 MKK7 （O14733）。节点距离显示在右侧。人类酶对Erk分支（TEY），JNK分支（TPY）和p38分支（TGY）的MAPK的特异性以红色表示。B）Y2H实验显示了EmMEKK1和EmMKK3之间的相互作用。左板，用于转染控制的SD-Leu-Trp;右板，SD-Leu-Trp-His与7，5 mM 3-氨基-1，2，4-三唑。1、阳性对照（T-抗原-AD×p53-BD）;2、阴性对照（T-抗原-AD×lamC-BD）;3， EmMEKK1-5'-AD x empty-BD;4， EmMKK3-BD x empty-AD;5， EmMEKK1-5'-AD x EmMKK3-BD.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010027.g004
为了确定EmMEKK1的下游交互伙伴，所有五个E的全长阅读帧。多房性将MKK克隆为pGADT7和pGBKT7，并在Y2H系统中针对各自的EmMEKK1克隆进行测试。由于几种EmMKK在与空的Gal4 BD载体结合时已经诱导了酵母生长，因此我们随后仅分析了融合到AD的EmMEKK1（5'和3'）与融合到Gal 4 BD并应用中到高严格条件的EmMKK的组合。在这些实验中，我们没有观察到EmMEKK1 3'部分与任何EmMKK的相互作用。另一方面，对于EmMEKK1 5'与EmMKK3的组合，一致观察到中等严格性相互作用（图4）。因此，就像在哺乳动物中，JNK分支（MKK4和MKK7）的MAPKK与MEKK1 [43 ]，E相互作用。multilocularis似乎还使用了至少一对JNK分支（EmMKK3）的MAPKK和MEKK1同源物（EmMEKK1）。的相互作用对。

E.多房性JNK EmMPK3 作为 EmMKK3 的下游交互合作伙伴

在MAPK的三个主要分支（Erk，p38，JNK）中，我们之前已经表征了E中的Erk样EmMPK1[15]和p38样EmMPK2 [17]。多房，但到目前为止还没有JNK家族的成员。为了研究棘球绦虫是否也表达MAPKs的第三个分支，因此我们对E进行了BLASP和互惠BLASTP分析。使用人类 JNK1 作为查询的multilocularis基因组。对于由位点 EmuJ_000174000编码的蛋白质，发现了61%相同氨基酸残基和76%相似残基的最高同源性，当BLAST针对SWISSPROT数据库进行分析时，还揭示了所有三种人类JNK亚型以及来自其他生物的JNK的最高同源性。MAPK可以通过激酶结构域激活环中的标记TXY基序来区分，该基序在Erk样激酶的情况下读取TEY，TGY用于p38 MAPKs，TPY用于JNK[44]。因此，EmuJ_000174000激活回路中编码了一种带有TPY的激酶，该激酶总体上显示出与人类JNK1和平面JNK的明确相同性（图5）。因此，我们给基因命名为emmpk3，它编码类似JNK的E。多房蛋白EmMPK3。转录组数据[27]表明emmpk3在元胸囊泡和原囊泡中表达良好。
图 5.EmMPK3的序列特征和相互作用.
A） Y2H实验显示了EmMKK3和EMMKK2与EmMPK3的相互作用。左板，用于转染控制的SD-Leu-Trp;右板，SD-Leu-Trp-His与7，5 mM 3-氨基-1，2，4-三唑。1、阳性对照（T-抗原-AD×p53-BD）;2、阴性对照（T-抗原-AD×lamC-BD）;3， EmMKK2-AD x EmMPK3-BD;4， EmMKK3-AD x EmMPK3-BD;5， EmMKK2-AD x empty-BD;6， EmMKK3-AD x empty-BD;7， EmMPK3-BD x empty-AD.B）不同来源的JNK的氨基酸序列比对。比较的是E的序列。多房性EmMPK3 （本作品;加入编号。MW358638），人类JNK1（HsJNK1;P45983）和Schmidtea mediterranea JNK（SmedJNK;AHL18082.1）. 完美对齐的位点（*）以及强（:)组或弱（.）相似性在对齐下方标记。激活环的 JNK 典型 TPY 基序由对齐上方的一条线显示。与SP600125相互作用的疏水性裂隙残基在比对上方用"+"标记。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010027.g005
为了研究EmMPK3是否与类似MKK4/7的MAPKK EmMKK3相互作用，我们再次使用了Y2H系统，将EmMPK3的全长读取帧克隆到pGADT7中，并针对上面提到的EmMKK3 BD融合对其进行了测试。如图5所示，EmMPK3和EmMKK3在中等强度条件下明显相互作用。这些数据表明，我们已经表征了E的完整JNK MAPK级联模块。由MAPKKK EmMEKK1，MAPKK EmMKK3和MAPK EmMPK3组成的多房型。有趣的是，我们还发现了EmMPK3和先前表征的MAPKK EmMKK2之间的相互作用，后者在棘球绦病Erk分支内是EmcRaf的下游相互作用伙伴，并作用于EmMPK1[16]的上游（图5）。

emmpk3在***棘球绦*虫干细胞中的表达**

如果emmekk1和emmpk3的编码蛋白构成功能性MAPK级联模块的一部分，人们会期望它们在元胚层的特定细胞中共表达。在干细胞耗尽的元胸囊泡的RT-qPCR实验中，与对照组相比，我们无法检测到emmpk3转录本的统计学显着减少（S2图），表明该基因至少在GC中没有特异性表达。为了进一步研究这些方面，我们在元孢子囊泡（分离物GH09）上进行了emmpk3的WISH实验，并结合增殖细胞的EdU标记。如图6所示，emmpk3的表达可以在两者中检测到增殖干细胞以及体外培养的分离株GH09囊泡中的许多有丝分裂后细胞（图6）。平均而言，这些囊泡中约75.9%的细胞（+/- 5.0%;n = 1074）没有对EdU或emmpk3进行染色，仅对EdU进行染色的3.2%（+/- 1.8%），仅对emmpk3进行染色的16.0%（+/- 6.1%），对于EdU和emmpk3则有另外4.9%（+/-1.4%）的双重染色（图6）。因此，总的来说，大约60.4%的EdU +细胞也染成emmpk3阳性，而所有emmpk3 +细胞中有23.4%与EdU共同染色。由于69%的所有增殖干细胞也显示出emmekk1的表达（见上文），这些数据表明，在元孢子囊泡中，至少有三分之一的增殖干细胞共表达emmekk1和emmpk3。
·
图 6.emmpk3在元胸囊泡中的表达.
A）在囊泡萌发层上的愿望。从左到右依次显示：核DAPI染色（蓝色），emmpk3 WMISH（绿色），EdU检测（红色）以及所有通道的合并。示例单元格由完整三角形（Edu+，emmpk3+），开放三角形（仅限Edu +）或箭头（仅emmpk3+）标记。条形表示 20 μm。B） WISH结果摘要。对于 EdU 和emmpk3（蓝色）、仅 EdU+ 细胞（红色）、仅emmpk3+ 细胞（绿色）和双染色细胞 EdU+/emmpk3 + （红色/绿色）阴性的细胞，值以百分比给出。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010027.g006

抑制剂SP600125对偏孢子囊泡和寄生虫干细胞的影响

接下来，我们研究了EmMPK3在寄生虫存活和生长中的作用。SP600125是一种广泛使用的ATP竞争性抑制剂，对JNK亚型[45]具有高特异性，已被用于研究JNK在无脊椎动物模型系统中的功能，如果蝇[46]和平面动物[23，24]。此外，参与SP600125与人JNK1[47]之间相互作用的所有JNK疏水性裂隙残基在EmMPK3中完全保守（图5），表明该化合物应有效抑制寄生虫酶。因此，我们进行了关于SP600125对寄生虫偏胚泡和干细胞（均来自分离株H95）的影响的实验。如图7所示，SP600125处理的变质囊泡在13天后在浓度为25μM时失去了结构完整性，并且在6天后我们已经观察到生发层的明显病变，并且在孵育13天后甚至更明显。为了研究对寄生虫干细胞群的影响，我们还对SP600125处理的囊泡进行了EdU染色实验。为此，在SP600125存在下处理13天后，将偏孢子囊泡彻底洗涤，随后在EdU中孵育5小时。如图7所示，我们观察到增殖干细胞的浓度依赖性降低，这在用25μM SP600125孵育后非常显着。另一方面，在短期暴露实验（用SP600125孵育72小时）中，没有观察到EdU +细胞的统计学显着减少，这表明需要几个周期的细胞分裂才能对寄生虫干细胞产生可检测的影响。-厦门杂志期刊论文发表

图 7.SP600125对变质囊泡和寄生虫干细胞的影响。
A）对元囊泡的影响。上图：用25μM SP600125孵育后体外培养的元孢子囊泡的显微镜图像。左：无抑制剂对照;中间： 25 μM SP600125 持续 6 天;右：25 μM SP600125 持续 13 天。生发层的病变以黑色三角形为标志。B） SP600125对EdU+细胞在生发层中百分比的影响。囊泡在SP600125存在下以指示的浓度孵育13天。左图：SP600125对生发层中EdU+细胞数量的剂量依赖性作用。三个生物重复的统计分析（***，p<0，0001）。右图：用0μM（对照）和25μM SP600125孵育的囊泡生发层中的EdU +细胞的例子。C）SP600125对原代细胞囊泡形成的影响。原代细胞培养物在SP600125存在下以指定浓度孵育19天，并计数完全成熟的囊泡。三个生物重复的统计分析。ns，不显著;*， p = 0，02;**， p<0，008.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010027.g007
SP600125对变质囊泡中干细胞增殖的影响可能是由于对发芽细胞的直接影响，也可能是由于干细胞的有丝分裂能力降低，由对周围组织的损害引起。因此，我们还测试了SP600125在生发干细胞中高度富集（>80%）的原代细胞培养物的能力[2]，以形成成熟的元胸囊泡。如图7所示，我们观察到干细胞囊泡形成明显减少，在5μM SP600125及以上浓度下显着减少。在25μM SP600125处，原代细胞未形成成熟的囊泡。综上所述，SP600125对囊泡完整性、元孢子囊泡细胞增殖以及生发细胞形成元胸囊泡的能力的影响表明EmMPK3在棘球绦干细胞功能中具有重要作用。

讨论

由于其在调节细胞增殖和分化方面的核心作用以及它们含有非常好的可药化酶的事实，MAPK级联模块是开发化疗治疗的有吸引力的靶标[13]。在E中。我们之前已经描述了几个MAPK级联组件，例如MAPKKK EmRaf [14]，MAPKKs EmMKK1和EmMKK2 [16]，以及MAPKs EmMPK1（类似Erk）[15]和EmMPK2（p38-like）[17]。至少对于其中一种组分EmMPK2，我们还表明，特定的小分子抑制剂也表现出深刻的抗E。多房活度[17]。同样，在最近两项关于Erk样信号级联的研究中，Cheng等人[48]和Zhang等人[49]证明，专门针对人类MEK1和MEK2设计的抑制剂具有针对E的抗寄生虫活性。多位异位异体和E。分别为原鳞毛蕨。与Erk样EmMPK1相反，Erk样EmMPK1与EmMKK2和EmRaf [16]形成完整的MAPK级联模块，EmMPK2含有几种氨基酸变化，使该酶具有组成活性[17]。此外，EmMPK2似乎不需要通过与上游MAPKK的相互作用来激活[16，17]。在这项工作中，我们现在演示E.多房性还表达MAPKs第三分支的成分，即JNK信号通路（图8），它在哺乳动物中调节许多关键过程，如运动性，细胞凋亡和新陈代谢[18]。在哺乳动物中，JNK信号传导的决定性上游激活剂之一是多功能MAPKKK MEKK1，其标志除了激酶结构域外，还是指导靶蛋白泛素化的RING基序[22]。有趣的是，mekk1同源物似乎在经过充分研究的无脊椎动物模型系统中不存在，例如果蝇和C。秀丽隐杆线虫，但至少有一种这样的分子已经在自由生活的扁虫Dugesia japonica中描述[26]。我们现在可以清楚地表明，寄生扁虫E。多位基因表达mekk1同源物emmekk1，并且相应的基因在寄生虫的大多数EdU +（增殖）干细胞中表达良好。因此，我们认为emmekk1在棘球绦虫干细胞维持或分化中实现其功能。由于我们还检测到有丝分裂后细胞中的emmekk1表达，因此我们倾向于将emmekk1参与干细胞分化，而不是干细胞维持或自我更新。MAPK级联模块，特别是Erk模块，在细胞分化过程中的一般参与支持了这一概念[13]。此外，在相关的D中击倒了 mekk1同源词。日本对EdU+新成虫的数量没有影响，而是导致新成虫分化为前置后代[26]。因此，我们认为emmekk1在有丝分裂期间和有丝分裂后直接在过渡细胞中表达棘球绦虫干细胞中表达，以调节末端分化过程，尽管这仍然需要实验验证。
图 8.E中 MAPK 级联交互作用的模型。多房 .
描绘的是E。多房性MAPK，MAPKK（MKK）和MAPKKK（MKKK）以及本工作和先前研究中发现的上游调节因素[14–17]。通过Y2H分析验证的相互作用显示为纯黑色箭头，假定的相互作用由黑色虚线箭头表示。红色星号表明EmMPK2是一种本构活性MAPK [17]。RTK，受体酪氨酸激酶。
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010027.g008
在Planarians中，neoblast动力学，特别是干细胞分化过程中的不对称细胞分裂受到EGF信号传导的调节[50]。在棘球绦虫中，EGF信号通过先前表征的EGF受体EMER[11]也刺激干细胞增殖，因此最有可能影响干细胞分化动力学[10]。EGF在哺乳动物中传递信号的关键下游效应器之一是Grb2，这是一种含有SH2和SH3的适配器分子，通常与EGF受体C端尾部的磷酸化酪氨酸残基（共识：pY-X-N-X）结合[21]。由于我们在Y2H系统中观察到EmMEKK1与棘球绦虫基因组编码的唯一Grb2-同源物EmGrb2之间存在强烈的相互作用，因此我们建议在E中。多房性EmMEKK1正在将信号从EGF受体EMER通过EmGrb2传输到下游MAPKK。有趣的是，保守的Grb2结合基序中的一个酪氨酸残基（Y1447YNT）存在于EmER [11]的C端尾，因此可以作为EmGrb2的对接站点。虽然需要进一步的实验来验证激活的EmER和EmGrb2之间的直接相互作用，但我们提出，与哺乳动物的情况类似，棘球绦虫利用Grb2和MEKK1同源物将EGF信号传递到下游信号通路。
我们克隆并表征了整个E集。多房性MAPKKs并通过酵母鉴定出两个杂交分析其中一个，EmMKK3，作为EmMEKK1的下游相互作用者。与Grb2的情况一样，这反映了哺乳动物的情况，其中JNK信号分支的MAPKK是MEKK1的相互作用者[51]。我们还不知道EmMEKK1是否也可以刺激寄生虫中的Erk信号传导，这是哺乳动物的典型特征[20]，并且已经建议用于Planarians[26]。至少EmMKK3是唯一与EmMEKK1相互作用的MAPKK，我们无法检测到EmMKK3与EmMPK1的相互作用，EmMPK1是唯一已知的棘球绦虫的Erk样激酶[15]。然而，除了EmMPK1-3之外，还有另外两个由E编码的MAPK。Mutilocularis基因组，两者都包含Erk-kinases（T-E-Y）的规范激活环基序。需要进一步的实验来确定EmMKK3是否可以与其中一个分子相互作用，然后该分子将在寄生虫中的EmMEKK1和Erk信号传导之间建立联系。
到Y2H时，我们观察到EmMKK3和EmMPK3之间存在明显的相互作用，这再次与哺乳动物的情况相匹配，并首次在棘球绦虫中建立了完整的JNK信号传导模块。使用一种针对哺乳动物JNK的抑制剂，该抑制剂已经用于研究平面动物的JNK信号传导[23，25]，我们观察到对成熟元胸囊泡和原代细胞培养物中干细胞功能的不利影响。在成熟的变质囊泡中，SP600125处理导致发芽层中存在的增殖干细胞逐渐丧失，并且在原代细胞培养物中，JNK抑制剂有效地阻止了干细胞中变脑囊泡的产生。我们还不能判断这些影响是由于抑制剂治疗时的干细胞消除，与JNK信号传导相关的细胞凋亡增加，还是由于细胞周期衰减。至少在D中。粳稻和S.地中海，JNK抑制特异性地干扰了G2/M相变[23，24]，这极有可能导致棘球绦虫的萌发细胞损伤。另一方面，我们观察到的SP600125处理囊泡的表型与我们之前观察到的囊泡的表型不同，在囊泡中，GC通过羟基尿素或Polo样激酶抑制剂Bi 2536处理而被特异性消除，但在体外培养2-3周内保持完整[2，36]，表示细胞更新缓慢。在我们目前的实验中，我们更早地观察到了囊泡的结构损伤。因此，我们提出SP600125除了直接影响棘球绦虫干细胞外，还影响分化或分化细胞，可能是那些emmpk3+但对EdU阴性的细胞。当然，我们不能排除25μMSP600125浓度升高（我们观察到最引人注目的表型）也涉及脱靶效应，特别是因为体外酶抑制测定表明SP600125，尽管对JNK比Erk-和p38样激酶以及最初测试的14种其他激酶具有高度选择性[52]，还影响其他几种具有类似IC的哺乳动物激酶50 [在平面中，亚致死剂量的SP600125（高达5μM）表象造就了由JNK特异性RNAi[25]诱导的无尾表型，表明至少在较低剂量下，SP600125似乎对扁虫几乎没有脱靶作用。在浓度为25μM时，SP600125对S是致命的。在极短的时间内（暴露30分钟至1小时）内进行中毒治疗[25]。由于在我们的实验中，至少观察到了7天的metacestode活力，因此我们假设我们还应用了亚致死剂量的SP600125（可能被囊泡中的大量包虫液淬灭），并且至少大多数观察到的表型，特别是5μM处对原代细胞培养物的抑制，是由于对EmMPK3的抑制。正如Chu等人先前报道的那样[52]，SP600125在人类中最有可能的替代靶点是有丝分裂检查点激酶Mps1（也称为TTK）和有趣的是E。multilocularis基因组还编码Mps激酶家族（EmuJ_000595100）的成员，该成员在原代细胞培养物和元胸囊泡[27]（S3 图）中表达。通过结构分析，Chu等人[54]鉴定出8个氨基酸残基，这些氨基酸残基对SP600125与Mps1的ATP结合口袋之间的相互作用特别重要。由于在棘球绦Mps激酶中，这些残基中有4个是相同的，并且剩余的残基具有相似的生化特征（S3图），因此不能排除SP600125对EmuJ_000595100基因产物的脱靶效应。因此，有必要进行进一步的生化分析，以区分SP600125对EmMPK3的特定影响和对棘球绦虫Mps激酶的脱靶效应的可能性。
棘球绦虫最显著的特征之一是后部组织，其中完全不存在像sfrp这样的前标记基因，而wnt1等后标记物在整个发芽组织中表达[5]。因此，由发芽层[5]内的肌肉细胞产生的wnt-通路的后配体极有可能是棘球绦虫GC产生后置后代的关键指导者。有趣的是，除了参与自由生活的扁虫中neoblasts的细胞周期调节[23，24]之外，JNK信号传导似乎还决定了分化干细胞的后验命运。正如Tejada-Romero等人[25]所证明的那样，对Planarian JNK（使用SP600125）以及RNAi对JNK的药理学抑制导致无尾表型并阻止建立后极所必需的wnt依赖性细胞反应。这也可能涉及自RNAi对D以来的平面mekk1同源词。粳稻MEKK1导致前后模式出现大量缺陷[26]，尽管到目前为止尚未建立平面MEKK1和JNK之间的直接联系。因此，EmMPK3的药理学抑制对有效阻止干细胞中偏孢子囊泡形成的原代细胞培养物的影响也可能是由于对寄生虫wnt信号通路的实质性干扰。至少在哺乳动物系统和平面系统中，先前已观察到JNK和wnt信号传导的组分之间的大量串扰[25]。这种相互作用的可能性目前正在我们的实验室进行调查。
总之，在这项工作中，我们首次表征了E的JNK信令模块。多房由类似MEKK1的MAPKKK，EmMEKK1，JNK分支的MAPKK，EmMKK3和JNK样分子EmMPK3组成。我们证明该模块在棘球绦虫干细胞中表达，并且JNK抑制剂对EmMPK3的抑制导致成熟偏胚泡中增殖干细胞的丧失以及阻止寄生虫干细胞形成变质囊泡的发育缺陷。因此，我们认为，与哺乳动物和扁平哺乳动物的情况类似，JNK信号传导在干细胞维持和动力学中发挥着重要作用。此外，由于JNK和wnt信号通路之间已经建立的串扰，EmMEKK1和EmMPK3可能是重要的信号传感器，可导致后部发育，因为它是棘球绦虫的特征。由于JNK信号通路对棘球绦虫干细胞功能的明显重要性及其组分对化学抑制的适应性，这为抗棘球蚴病药物的开发开辟了新的途径。为此，必须利用EmMPK3和哺乳动物JNK的ATP结合口袋的结构差异，类似于人JNK1-3和Mps1激酶[54]之间的结构差异，用于基于结构的药物设计，以产生对寄生虫酶具有高度选择性的化合物。

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本研究中研究的基因列表和引物序列。
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作者感谢Raphael Duvoisin和Stefanie Riedl提供向量结构，并感谢Dirk Radloff的出色技术援助。

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抽象

背景

方法/主要调查结果

结论/意义

作者简介

数字

介绍

方法

道德声明

生物体和培养方法

核酸分离、克隆和测序

原位杂交和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记

酵母二杂交 （Y2H） 分析

RT-qPCR对羟基脲（HU）-和Bi2536处理的偏孢子囊泡

抑制剂研究

计算机分析和统计

结果

E的克隆和表征 。multilocularis mekk1 ortholog

emmekk1在E中的表达式 。多房干细胞

EmMEKK1的上游互动合作伙伴

EmMEKK1下游互动合作伙伴

E.多房性JNK EmMPK3 作为 EmMKK3 的下游交互合作伙伴

emmpk3在棘球绦虫干细胞中的表达

抑制剂SP600125对偏孢子囊泡和寄生虫干细胞的影响

讨论

支持信息

S1 表。本研究中研究的基因列表和引物序列。

S1 图E的表达式 。幼虫阶段的多位基因。

S2 图RT-qPCR分析了干细胞耗尽的元胸囊泡中emmekk1和emmpk3的表达。

S3 图人与棘球蚴Mps激酶的氨基酸序列比对。

确认

引用

酵母二杂交（Y2H）分析

E的克隆和表征。multilocularis mekk1 ortholog

emmekk1在E中的表达式。多房干细胞

emmpk3在***棘球绦*虫干细胞中的表达**

S1 图E的表达式。幼虫阶段的多位基因。

**S2 图RT-qPCR分析了干细胞耗尽的元胸囊泡中emmekk1和emmpk3的表达。**

S3 图人与***棘球蚴*Mps激酶的氨基酸序列比对。**