厦门免费医学论文发表-精子发生过程中的染色体分离是通过全中心蛾物种中独特的中心动力学机制发生的

克里奥·霍肯斯，埃尔南·洛伦齐，Tricia T. Wang，艾丽莎·雷（Elissa P. Lei），莉亚·松香 抽象 生殖系中染色体动态的精确调节对于跨物种的繁殖成功至关重要。然而，减数分裂染色体事件（如同源物配对和染色体分离）的机制在许多物种中尚不完全清楚。在这里，我们使用 Oligopaint DNA FISH 研究了全心食品储藏室蛾 Plodia interpunctella 中减数分裂同源物配对和染色体分离的机制，并将我们的发现与新的和以前的研究进行了比较蚕蛾， Bombyx mori，它与 P.1亿多年前的间点。我们发现 Bombyx 和 Plodia 精子发生的配对都是在富含基因的染色体末端开始的。此外，这两个物种在中期 I 形成杆状十字形二价。然而，与在Bombyx中观察到的端粒定向染色体分离机制不同，Plodia可以在中期I以多种不同的方式定向二价。 令人惊讶的是，在这两个物种中，我们发现动粒始终聚集在非端粒位点上，朝向染色体的中心，而不管染色体中心位于二价的哪个位置。此外，姐妹着丝粒在这些物种中似乎没有配对。相反，在中期I很容易观察到四种不同的着丝粒。尽管如此，我们还是发现了清晰的末端微管附着，而不是将这些分离的动粒连接到减数分裂纺锤体的侧微管附着。这些发现挑战了经典的分离观点，即在减数分裂I中，需要成对的、朝极的着丝粒才能进行准确的同源物分离。我们在这里的研究强调了探索非模型系统中基本过程的重要性，因为使用新的生物体可以导致发现新的生物学。 作者摘要 为了使遗传信息准确地从一代传递到下一代，在称为减数分裂的过程中制造卵子和精子细胞时，母系和父系染色体拷贝（同源物）必须相互分离。为了促进这种平等的分裂，同源伴侣从头到尾配对，进行遗传信息交换，然后形成称为动粒的大型蛋白质复合物以实现染色体分离。在这里，我们研究了两种不同飞蛾物种的精子形成过程中同系物如何配对以及动粒如何形成：Bombyx mori（蚕蛾）和 Plodia interpunctella（食品储藏室蛾）。结合显微镜方法，我们观察到同源物似乎通过染色体末端的相互作用配对。相反，我们发现着丝粒在染色体中心形成，远离染色体末端。即使染色体折叠成不同的构型也是如此。这些中央着丝粒是功能性的，能够募集微管，微管是物理上将染色体拉开进行分离的结构。染色体中心如何被指定为减数分裂中的着丝粒募集位点，以及导致不同染色体折叠构型形成的原因，是未来研究的领域。 数字 图4图5图6图1图2图3图4图5图6图1图2图3 引文： Hockens C， Lorenzi H， Wang TT， Lei EP， Rosin LF （2024） 精子发生过程中的染色体分离通过全中心蛾物种独特的中心动力学机制发生。PLoS 基因 20（6）： 编号：E1011329。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329 编辑：R. Scott Hawley，美国斯塔尔斯医学研究所 收到： 2023年10月13日;接受： 2024年6月3日;发表： 6月 24， 2024 这是一篇开放获取的文章，不受任何版权保护，任何人都可以出于任何合法目的自由复制、分发、传输、修改、构建或以其他方式使用。该作品在知识共享CC0公有领域奉献下提供。 数据可用性： 所有数据都包含在手稿中。手稿中使用的原始代码可以在这里找到：https://github.com/TriLab-bioinf/LEI_ROSIN_2023。 资金：“这项工作由美国国立卫生研究院尤尼斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所的校内计划资助（包括 C.H.、T.T.W. 和 L.F.R. 的工资;HD009019-01 至 L.F.R.;https://www.nichd.nih.gov/about/org/dir），以及美国国立卫生研究院国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所的校内计划（包括 HL 和 EPL 的工资;DK015602 to E.P.L.;https://www.niddk.nih.gov/about-niddk/offices-divisions/division-intramural-research）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。 利益争夺： 作者声明不存在相互竞争的利益。 介绍 染色体分离是体细胞和生殖系组织细胞分裂的重要组成部分。在生殖系中专门的减数分裂细胞分裂中，染色体在染色体分离发生之前会经历复杂的多步骤比对过程。首先，染色体变得更加线性，然后同源染色体（同一条染色体的母系和父系拷贝）相互发现并首尾配对。这种端到端配对允许交叉重组和交叉的形成，将同源染色体连接在一起。这些键有助于中期 I 纺锤体上同源物的正确双取向，其中同源动粒必须面向相反的纺锤体极才能准确分离染色体。这些步骤中的每一个都需要准确执行，以避免减数分裂过程中的染色体分离缺陷，例如不分离。 尽管早期减数分裂过程中发生的过程在很大程度上是保守的（同源物配对、重组和分离），但研究人员发现，不同的分子机制在不同物种中介导这些过程。例如，在果蝇果蝇的雄性和雌性减数分裂中，着丝粒和中心周围异染色质与减数分裂进入时（甚至之前）的早期减数分裂配对事件有关[1–8]，着丝粒也介导中期I.的染色体分离（见[6,9]）。在秀丽隐杆线虫中，染色体特异性序列及其顺式作用结合伴侣在染色体远端区域（臂状区域）形成“配对中心”，促进同源物识别[10\u201214]，染色体分离是通过端粒面向纺锤体极点和着丝粒杯在染色体周围形成的机制介导的（见[15,16]).尽管有这些发现，但在大多数其他物种中，同源物如何在三维核空间中相互发现并区分同源伴侣和异源染色体尚不清楚。此外，在减数分裂I期间介导染色体双向和分离的机制仍然不是很清楚，特别是在全心物种中（在有丝分裂期间，动粒沿着染色体的长度形成）。 全心物种，如飞蛾和 C。与有丝分裂相比，线虫在减数分裂过程中面临明显的挑战[17,18]。由于重组通常在不同物种的染色体的着丝粒-近端区域受到抑制[19–21]，因此可以合理地预测，在减数分裂期间维持全中心结构可以在很大程度上抑制重组。此外，在减数分裂I.和减数分裂II.期间，着丝粒必须在中期平板上双向，以便染色体正确分离[22,23]。如果重组确实发生并导致十字形二价（一种十字形结构，长臂和短臂相互垂直），则沿着染色体长度的所有着丝粒将意味着着丝粒面向许多不同的方向，这可能导致双取向失败[17]。因此，全心物种必须在减数分裂过程中进化出与有丝分裂期间使用的染色体分离机制不同的机制。迄今为止，在全心物种中已经发现了三种减数分裂特异性机制：1）倒置减数分裂，其中姐妹染色单体在同源物之前分离，并且全心结构至少部分维持[24\u201227]，2）端粒（或端动样）减数分裂，其中端粒或远端染色体区域成为着丝粒募集位点[28,29]，以及3）染色体重组，如C所示。线虫，端粒朝向纺锤体极，着丝粒杯在染色体周围形成[16,29–34]。 我们之前在蚕蛾Bombyx mori的研究表明，端粒附近富含基因的染色体结构域有助于同源物识别，并且端粒面向纺锤体极，以便在雄性种系中分离染色体[35]。然而，这些发现是否适用于所有鳞翅目昆虫（其中有近200,000种，跨越超过1.2亿年的进化）尚不清楚。在这里，我们结合了Oligopaint DNA FISH和免疫荧光来研究高度分化的食品储藏室蛾Plodia interpunctella的减数分裂染色体动力学，并将我们的发现与Bombyx中的新工作和以前的工作进行比较。Plodia是鳞翅目遗传学和基因组学的一个很有前途的新实验室模型。虽然 Bombyx 几十年来一直被用作鳞翅目动物系统的模型，但创建转基因 Bombyx 极具挑战性，饲养这些大型昆虫的喂养和空间需求使它们不适合实验室研究。另一方面，Plodia体积小，胚胎易于注射，最近的几项研究表明，使用CRISPR和PiggyBac技术创造转基因菌株非常成功[36,37]。 我们在这里的研究表明，使用Plodia作为模型系统来研究减数分裂染色体生物学的保守和发散方面是合适的。使用 Oligopaints 沿着 Plodia 幼虫睾丸中单个染色体标记多个结构域，我们发现 Plodia 精子发生的配对是在富含基因的染色体末端开始的，类似于 Bombyx。此外，Bombyx 和 Plodia 在中期 I 形成棒状十字形二价。然而，虽然 Bombyx 二价在精子发生的中期 I 总是具有指向纺锤体极的端粒，但我们发现 Plodia 二价可以是“端粒定向”（端粒面向纺锤体极）或“中心导向”（染色体中心朝向纺锤体极）。有趣的是，我们发现 Plodia 和 Bombyx 都在非端粒位点朝向染色体中心形成着丝粒，即使端粒朝向纺锤体极。我们称之为“中心动力学”染色体分离。有趣的是，这些中央着丝粒似乎在姐妹染色单体之间没有配对，导致具有四个不同着丝粒焦点的中期I结构。尽管动粒之间的间距很大，但我们观察到由末端微管附着介导的清晰共取向。这种染色体分离模式似乎与这些飞蛾在有丝分裂期间采用的机制完全不同，在有丝分裂期间它们是全心的，并且与以前描述的全心物种中其他减数分裂分离机制不同。总之，我们的研究表明，独特的机制决定了鳞翅目精子发生中的染色体分离动力学。 结果 使用 Oligopaints 可视化 Plodia interpunctella 雄性生殖系中的染色体 为了在减数分裂过程中可视化 Plodia 染色体，我们设计并生成了针对 30 个 Plodia 常染色体中的 5 个的 Oligopaint 文库。由于我们之前在 Bombyx 中的研究表明染色体大小和基因分布可能会影响减数分裂染色体动力学，因此我们设计了针对三条大、一条中等和一条小 Plodia 染色体的探针，这些染色体上的基因分布不同（第 5、11、15、19 和 27 章;图1A）。我们在这里的油漆设计重点是在这些染色体上创建一个三条纹图案，探针标记远端臂状区域（称为 Arm1 或 Arm2 探针——以下简称“臂”）和中央区域的中间（中心探针，图 1A）中的单拷贝序列。这使我们能够不仅在减数分裂过程中可视化单条染色体，而且还可以分析前面描述的特定亚染色体结构域的动态[35]。 缩略图 下载： PPT的PowerPoint幻灯片 巴布亚新几内亚放大图片 TIFF的原始图像 图 1. Plodia interpunctella的寡涂设计和特异性。 A. Plodia ch5、11、15、19 和 27 的 Oligopaint 设计示意图。下面的灰线表示基因的位置。B-F） 来自 Plodia 5 的 Pachytene 核第龄幼虫睾丸用 Oligopaints 标记，用于 Plodia ch5 （B）、11 （C）、15 （D）、19 （E） 或 27 （F）。Arm1 探头以青色显示。中心探头以黄色显示。Arm 2 探头以洋红色显示。DAPI 以灰色显示。比例尺 = 5 μm。虚线表示近似的核边。G） 来自 Plodia 5 的有丝分裂前中期（左）和有丝分裂中期（右）细胞第用 Arm1、Center 和 Arm2 探针标记的 Plodia ch15 的龄幼虫睾丸南瓜，如 B 所示。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.g001 我们最初用于设计ch5、19和27涂料的基因组处于草稿状态（组装成具有许多未映射重叠群的大型染色体大小支架）[38]。从那时起，一种新的染色体水平基因组组装被释放出来，用于设计ch11和15的涂料[39]。将这两个基因组版本相互映射，揭示了基因组草案和染色体水平组装之间的高度保守性，对我们的五条靶向染色体具有特别高的保真度（S1A-S1F图）。此外，将新的 Plodia 基因组映射到最新版本的 B.mori基因组揭示了这两个物种之间的高度同步性（S1G图）。为了进一步验证 Plodia 基因组组装的准确性，将条纹 Oligopaints 应用于 5第龄幼虫睾丸显示出从每条染色体的一个端粒到另一个端粒的预期线性模式（图1B-1F），生殖系的有丝分裂细胞也是如此（图1G）。这些检测总之验证了 P。点间基因组组装，并证明了我们的寡核苷酸的特异性。 同源物配对在 Plodia 中富含基因的染色体末端启动 我们之前对 Bombyx 的研究表明，雄性种系中的减数分裂同源物配对是在富含基因的染色体末端开始的。为了测试这种机制在 1 亿多年前与 Bombyx 分道扬镳的 Plodia 中是否保守，我们使用上述条纹 Oligopaints 一次标记一条染色体，以量化当细胞通过早期减数分裂前期（图 2A）时，哪些染色体区域（臂或中心）首先配对第龄幼虫睾丸。对所有绘制染色体的 Arm1、Arm2 和中心结构域探针之间的配对分析表明，与 Bombyx 一样，Plodia 中的配对在远端染色体臂结构域处比中心结构域更频繁地启动（图 2B）。 缩略图 下载： PPT的PowerPoint幻灯片 巴布亚新几内亚放大图片 TIFF的原始图像 图 2. 减数分裂配对在 Plodia 中富含基因的染色体末端开始。 左图：Plodia ch15 Oligopaints示意图。右图：用 Plodia ch15 条纹涂料标记的细胞核，代表在 Plodia 5 的前期 I 期（Leptotene、Zygotene、Pachytene、Diplotene、Diakinesis）和 Prometaphase I 中观察到的各种染色体构型第龄幼虫睾丸南瓜。Arm1 探头以青色显示。中心探头以黄色显示。Arm 2 探头以洋红色显示。DAPI 以灰色显示。比例尺 = 5 μm。蜂群图显示了具有指定染色体区域（X 轴）开始配对的染色体的比例。每个点代表单个染色体的平均数据。线 = 平均值。误差线 = SD. *** p < 0.0001。费舍尔精确检验。对于B-D，每条染色体的数据来自两到三个重复实验（两个不同的FISH实验各两个睾丸）的平均四个睾丸。条形图显示了 Plodia ch5、11、15、19 和 27 手臂特异性染色体配对启动的平均值和标准差。p < 0.0001，** p = 0.0005，* p = 0.01。费舍尔精确检验。对于 B 和 C，配对由存在的 FISH 信号数量决定，单个（连续）FISH 信号表示“配对”，肉眼可检测到的两个不同的 FISH 信号表示“未配对”。这在非常早期的受精糖细胞中被定量，其中三个FISH信号中只有一个是配对的，另外两个仍未配对。显示 Arm1：Arm2 配对起始比（X 轴）与 Arm1：Arm2 基因密度比（Y 轴）的散点图。每个探针结构域的基因密度计算为 Oligopaint 绘制的总碱基对中基因覆盖的碱基对。用于计算最佳拟合线 R 的线性回归2和 p 值。对于 B-D，n > 300 个细胞，跨越 Pi 5、19 和 27 的四个重复。n > pi 11 和 15 的三个重复的 200 个细胞。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.g002 有趣的是，当我们进一步分解这些配对数据以检查配对是否优先于每条染色体上的另一只手臂与另一只手臂相比，我们发现两只手臂都可以启动配对，但有时会偏向于一只手臂（图 2C）。例如，ch5 上的 Arm1 比 Arm2 更有可能启动配对。相反，与 Arm1 相比，ch19 上的 Arm2 启动配对的可能性要大得多（图 2C）。在Bombyx中，我们之前观察到染色体臂之间的配对起始存在类似的偏差，并发现配对起始与基因密度密切相关，富含基因的手臂比基因贫乏的手臂更早配对[35]。在Plodia的数据中也观察到了同样的相关性（图2D和S2A），这表明富含基因的染色体臂可能在鳞翅目中广泛启动配对。总之，我们发现配对开始发生在 Plodia 染色体臂的远端区域，富含基因的臂更有可能在基因贫乏的臂之前配对。 在 Plodia 中，中期 I 的二价取向因细胞而异 与有丝分裂相比，减数分裂期间同源物的对称分离需要对染色体结构进行特定更改，以使同源物在中期 I 时具有适当的双向性。我们之前在Bombyx上的研究表明，中期I的二价是双向的，因此同源物在一个远端臂结构域保持连接，而另一个臂面向纺锤体极[35]。在这里，我们将这种二价构型称为“端粒导向”，因为离纺锤体极最近端的染色体结构域是端粒。为了了解二价在 Plodia 的精子发生中是否也以端粒为导向，我们使用条纹寡绘图来可视化染色体臂和中心在中期 I 的位置。 令人惊讶的是，我们的分析显示，我们分析的五种染色体二价仅在 70-90% 的细胞中处于端粒导向的构型（图 3A、3B 和 S2B）).在其余 10-30% 的细胞中，染色体的中心区域面向纺锤体极（中心定向二价;图3A、3B和S2B）。在这种面向中心的构型中，同源物似乎在中期I.在中期I.在中期I之前也可以观察到一个端粒连接或两个端粒连接的二价（S3A图）。 缩略图 下载： PPT的PowerPoint幻灯片 巴布亚新几内亚放大图片 TIFF的原始图像 图 3. 在 Plodia 精子发生的中期 I 期，二价取向因细胞而异。 来自 Plodia 的代表性中期 I 细胞 5第用 ch5 Oligopaints 标记的龄幼虫睾丸南瓜。Oligopaints的原理图如上图所示。Arm1 探头以青色显示，中心探头显示为黄色，Arm 2 探头显示为洋红色，DAPI 显示为灰色。比例尺 = 1 μm。星号表示主轴极。二价方向的缩放和卡通示意图（底部）显示在右侧。条形图显示了第 5、11、15、19 和 27 章的中期 I 方向的量化。Ch5， n = 233 （30.5% Arm1 朝向极点，39% Arm2 朝极点，30.5% 中心朝极点）。Ch11，n = 215（47% Arm1,48% Arm2,6% 中心）。Ch15，n = 308（42% Arm1,53% Arm2,6% 中心）。Ch19，n = 269（44% Arm1,51% Arm2,5% 中心）。第 27 章，n = 184（53% Arm1,40% Arm2,7% 中心）。总而言之，当使用 Fisher 精确检验比较 Arm1 和 Arm2 极地百分比时，p > 0.05。在两个不同的FISH实验中，每个睾丸来自不同的幼虫，每次FISH测定均对n = 3-5个睾丸进行。来自Plodia 5的代表性中期I细胞第龄幼虫睾丸南瓜与 ch5 Oligopaints 和 ch19 Oligopaints 共同标记。低聚涂料的原理图以 C 表示，比例尺 = 1 μm。星号表示主轴极。右图：单个二价的缩放和二价构型的卡通。上图：用于分析C中ch5和ch19之间二价配位的寡核涂料示意图。 中图：卡通图，两条染色体都处于中心位置（左），而ch5染色体处于中心位置，ch19染色体处于端粒方向配置（右）。下图：条形图显示了 ch5 和 19 之间显示二价配位的细胞百分比的平均值和标准误差，如 C 所示。 二价配位定义为两条染色体在中期 I 显示相同的方向（端粒定向/中心定向）。其余细胞以端粒为导向的配置显示两条染色体。对来自两个幼虫的两个睾丸进行定量（两个技术重复和两个生物学重复;总共 4 个重复），每个性腺的 n 个> 50 个细胞。* p = 0.03，双尾韦尔奇 T 检验。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.g003 在中期 I 端粒定向构型的 70-90% 染色体中，没有观察到两个端粒中的哪一个面向纺锤体极的显着偏差（图 3B）。对于 ch5,40% 的染色体处于 Arm1 导向位置（Arm1 探针面向两极），28% 的染色体处于 Arm2 导向位置 （p = 0.3;费舍尔精确检验将观察到的与预期的比较，预期为 50：50）。对于 ch11,46% 是面向 Arm1 的，47% 是面向 Arm2 的 （p = 1.0）。对于 ch15,58% 是面向 Arm1 的，36% 是面向 Arm2 的 （p = 0.11）。对于 ch19,45% 是面向 Arm1 的，48% 是面向 Arm2 的 （p = 0.66）。最后，对于 ch27,55% 是面向 Arm1 的，38% 是面向 Arm2 的 （p = 0.25）。这表明两个端粒在中期 I 面向纺锤体极和定向二价的可能性相同。 有趣的是，我们没有发现强有力的证据表明细胞中的所有染色体在给定时间都采用相同的二价取向（并非所有染色体都面向中心或全部面向端粒）。由于最常见的二价取向是端粒定向，当在单个细胞中共同分析第 5 章和第 19 章时，两条染色体在细胞群中通常都是端粒定向的。同样，在单个细胞中，如果发现一条染色体是面向中心的，则另一条染色体通常仍然是端粒面向的，而不是两个染色体都面向中心（图3C和3D）。因此，整个细胞似乎不会同时在所有二价细胞中采用中心定向。FISH进一步支持了这些数据，昆虫五聚体端粒重复序列[40]在变动力学细胞中显示双臂相连的圆形二价和同一细胞中一只手臂相连的线性二价（S3B图）。总而言之，我们发现中期I二价取向不仅在细胞之间会有所不同，而且在同一细胞中的不同染色体之间也会有所不同，在整个细胞群中，不同的染色体区域面向纺锤体极。 在Plodia的中期I使用一种新的“中心动力学”机制分离同源物 一些二价在中期 I 是端粒定向的，而有些是中心定向的，这一事实向我们表明，着丝粒在染色体上的位置可能因细胞而异，动粒在面向纺锤体极的任何染色体区域形成。或者，动粒总是可以沿着染色体的整个长度形成，保持全心结构并确保任何面向两极的染色体区域都可以直接分离染色体。为了区分这两种可能性，我们进行了co-IF-FISH标记外着丝粒蛋白Dsn1（Mis12复合物[41,42]的组分）和ch5条带。ch5 的两个臂都用相同的颜色标记，ch5 的中心用单独的颜色标记，以区分端粒定向和中心定向的二价（图 4A、S4A 和 S4B）。 缩略图 下载： PPT的PowerPoint幻灯片 巴布亚新几内亚放大图片 TIFF的原始图像 图 4. 同源物通过 Plodia 精子发生中的“中心动力学”机制分离。 来自 Plodia 的代表性中期 I 细胞 5第用 ch5 Oligopaints 和 Dsn1 IF 标记的龄幼虫睾丸南瓜，显示中心定向染色体（上两行）或端粒定向染色体（下两行）。Oligopaints的原理图如上图所示。Arm1 和 Arm2 探针以洋红色显示，中心探针以黄色显示，Dsn1 IF 以绿色显示，DAPI 以蓝色显示。比例尺 = 2 μm。第 2-5 列是第 1 列中绘制染色体的缩放。二价的卡通示意图如右图所示。星号表示主轴极。放大图中显示的其他 Dsn1 信号是其他染色体上的着丝粒。B）. 线图显示了来自 A 的绘制染色体二价的信号定位。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.g004 引人注目的是，该测定表明，无论二价取向如何，动粒都局限于染色体中心，而不是我们预测的任何模型（图4A）。具体来说，我们发现 Dsn1 位于所有检查的中期 I 细胞（n = 99 个细胞，跨越 3 个生物学重复）中 ch5 中心探针的内或边缘。无论 ch5 是端粒导向构型 （n = 72） 还是中心导向构型 （n = 27;图4A）。在检查ch11时也看到了类似的结果（S4C图）。我们称之为“中心动力学分离”，其中动粒仅位于染色体的中心（而不是沿着远端染色体臂）。为了确认 Plodia 在有丝分裂期间是全中心的，并且并不总是包含中心定位的动粒，我们使用 PiD2 Plodia 培养的细胞 [43] 进行了有丝分裂染色体扩散，并用 Dsn1 IF 标记这些细胞（S4D 图）。该实验验证了 Plodia 在有丝分裂过程中确实是全心的，并且中央限制的着丝粒具有减数分裂特异性（甚至可能是精子发生特异性）。 这个令人惊讶的结果让我们想知道着丝粒在B中的位置。森精子发生。尽管Bombyx总是显示端粒定向的二价，并且着丝粒蛋白似乎存在于中期I的染色体末端附近[35]，但我们想知道动粒实际上是否比以前在Bombyx中理解的更远离端粒。为了测试这一点，我们在 Bombyx 4 中使用 Dsn1 和 Bombyx ch15 条纹涂料进行了相同的 co-IF-FISH 测定第-5第龄幼虫睾丸南瓜（S5图）。令我们惊讶的是，这个实验表明，像Plodia一样，Bombyx端粒并不用于着丝粒的形成，尽管它们的位置朝向极点。相反，我们观察到 Dsn1 定位远离端粒并靠近染色体中心，就像在 Plodia 中一样（S5 图）。 总之，这些数据表明，飞蛾可以在精子发生过程中采用一种新的“中心动力学”分离机制，其中动粒的形成仅限于染色体的中心。这是一种独特的机制，不同于这些物种采用的有丝分裂全运动或全心分离机制。它也不同于之前描述的全心物种的减数分裂机制：端动、着丝粒杯和倒减数分裂。最后，中心动力学分离不同于经典的“单中心”分离机制（如在苍蝇和哺乳动物中观察到的那样），在后者中，着丝粒在每个有丝分裂和减数分裂细胞中由组蛋白 H3 变体 CENP-A 定义的内源性着丝粒位点形成。 位于中央的动粒通过末端附着募集微管 我们注意到，在Plodia和Bombyx中，同源物的两侧都存在两个不同的姐妹着丝粒，而不是在其他物种的减数分裂过程中观察到的单个成对的着丝粒[44]。这可能会给同源物的正确双取向带来问题，因为两个姐妹动粒需要共同定向（从同一纺锤体极连接到微管上）。我们在这里观察到的姐妹着粒“分裂”（图4、S4和S5）先前已被证明会增加不正确的微管附着的可能性，例如姐妹着丝粒在中期I期间从相反的纺锤体极附着到微管上[45,46]。因此，我们想知道这些分离的着丝粒是否真的具有功能并募集微管，或者它们是否可能是退化的，并且微管附着是通过这些系统中的替代机制发生的。 为了确定这些 Dsn1 病灶是否位于功能性动粒上，我们首先询问我们是否可以在染色体上的相同中心位置看到其他着丝粒蛋白，这表明那里存在完整的着丝粒复合物。为此，我们使用抗CENP-T抗体（一种内部着丝粒蛋白）进行IF，并分别使用抗Spc24/25（一种外部着丝粒蛋白（NDC80复合物的一部分）进行IF[47]。虽然我们在减数分裂前期（瘦素）中没有观察到强大的 CENP-T 信号，但我们发现通过厚层，CENP-T 沿着染色体轴的长度定位，在那里它与其他轴蛋白（如粘连蛋白）共定位（S6A 和 S6B 图）。虽然有些令人惊讶，但这一结果与最近关于Bombyx mori雌性减数分裂中着丝粒形成的数据一致，该数据显示，动粒蛋白最初作为二价桥的一部分定位在同源物之间，直到中期I后期，当动粒切换到更规范的朝极位置时[48]。同样，在 Plodia 精子发生中，我们发现在中期 I 时，CENP-T 被限制在染色体的中心，与我们的 Dsn1 染色一致（S6C 和 S6D 图）。这些发现表明，非中心 CENP-T 被移除或重新定位，为中期 I 的“中心动力学”定位做准备。 重要的是，我们还观察到 Spc-24/25 存在于 Bombyx 中期 I 的中央染色体位置（我们有针对该蛋白质的特异性抗体;S6E 图），表明外部着丝粒在那里被招募，并支持中心着丝粒起作用的模型。 为了验证这些在染色体中心形成的着丝粒是功能性的并募集微管，我们在 Plodia 幼虫睾丸南瓜上使用抗微管蛋白混合物（参见方法）和抗 Dsn1 进行 IF，以可视化中期 I 的着丝粒和微管。这揭示了微管束在中期 I 时与动粒的明显末端附着，即使对于动粒明显远离染色体最极端部分形成的二价（图 5）。此外，在所有观察到的细胞中，姐妹着丝粒似乎都是共同取向的，二价似乎定位得同源物（不是姐妹）面对相反的两极（图5）。这些数据反映了我们之前在Bombyx精母细胞中期I期微管附着的发现[35]。总之，这些发现支持了这样一种观点，即我们在飞蛾精子发生中观察到的中央限制着丝粒是功能性的，并且代表了全心物种减数分裂染色体分离的新模式。 缩略图 下载： PPT的PowerPoint幻灯片 巴布亚新几内亚放大图片 TIFF的原始图像 图 5. Plodia 精子发生中的动粒通过末端附着募集微管。 A 和 B） 来自 Plodia 幼虫睾丸南瓜的中期 I 细胞的代表性 IF 图像显示 DAPI 为蓝色，微管为洋红色，Dsn1 着丝粒为绿色。从左到右：整个纺锤体可见的细胞区域，单个细胞缩放，然后是单个染色体缩放。放大的细胞和染色体由上一个面板中的虚线框表示。比例尺 = 5 μm。检查 n = 30 个中期 I 细胞，每个细胞进行两次生物学重复（总共 ~60 个细胞）。100% 显示直接着丝粒-微管附着，而不是侧向附着。C） 上面 A 和 B 中所示的单染色体缩放的卡通示意图。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.g005 讨论 在这里，我们首次采用Oligopaint DNA FISH技术来表征全中心食品储藏室蛾Plodia interpunctella的减数分裂染色体动力学。通过以亚染色体分辨率可视化单条染色体，我们发现精子发生过程中的减数分裂同源物配对是在富含基因的染色体末端开始的。这一发现反映了我们之前对Bombyx mori的研究，表明这种机制可能在鳞翅目昆虫中广泛保守。转录、转录机制或转录本身是否有助于鳞翅目中的同源物识别和配对是未来研究的领域。事实上，转录与其他物种的减数分裂配对有关，例如S。Pombe[49,50]，以及从苍蝇到人类的体细胞配对[51\u201254]，表明配对可能受到不同物种的类似机制的调节。基因密度如何影响其他早期减数分裂事件，例如双链断裂的形成，以及 Plodia 精子发生中的配对是否真的需要断裂，这些都是正在进行的研究领域。 有趣的是，虽然配对是在染色体末端开始的，但染色体末端并不用于 Plodia 中期 I 的染色体分离。相反，我们观察到二价可以在中期 I 以端粒或中心定向的构型定位（端粒或中心分别面向纺锤体极）。此外，染色体中心在 Plodia 精子发生中充当着丝粒募集位点。在Bombyx精子发生中观察到类似的机制，尽管该物种的端粒总是朝向纺锤体极。这种分离机制不同于在全心线虫 C 中观察到的基于杯的分离机制。秀丽隐杆线虫[15,16]和在一些全心植物中观察到的倒减数分裂[17]。 端粒和中心定向的二价是如何形成的尚不清楚。像 Bombyx，C。 秀丽隐杆线虫在中期 I 也具有专门的端粒定向二价。秀丽隐杆线虫，这种结构是通过交叉调节实现的。C 中的分频器。秀丽隐杆线虫几乎总是局限于每条染色体一个，这些交叉形成于两个远端臂状区域之一[55\u201260]。与交叉同源物的臂状区域保持连接并沿中期I.板定位，而相反的臂状区域指向纺锤体极[16,31,61–63]。类似的机制可以解释飞蛾中端粒和中心定向二价的形成，但这尚未经过实验测试。例如，在所有Bombyx和一些Plodia细胞中观察到的端粒定向二价可能是单个远端交叉的结果，这与鳞翅目每条染色体的单一交叉的研究一致[64\u201266]。相反，我们对一些中心定向的二价物的观察表明，这些同源物之间形成了两个交叉，其中两个染色体臂仍然连接在中期 I 板的中心。最近的数据表明，一些染色体确实在Papilio蝴蝶中具有两个交叉点[67]。 另一种可能性是，Plodia中的同源物在中期I仍然通过非交叉机制连接，例如在果蝇雄性，Bombyx雌性和C中报道的那些。线虫[48,68–74]。事实上，我们没有观察到染色体长度和中心方向的二价之间有很强的相关性，这确实支持了一个模型，即这些中心方向的二价不完全是由双交叉形成的（我们预计对于更长的染色体来说，这种交叉会更频繁）。 虽然在我们看来，在中期 I 观察到的面向中心的二价物最有可能代表在染色体两端物理连接的同源物，但这些结构也有可能是一种瞬态状态。在这种情况下，端粒定向构型将是中心定向构型的前体，然后通过减数分裂纺锤体将中央着丝粒结构域拉向两极，翻转同源物并产生两个臂结构域在中期 I 板上彼此相对的结构来实现。然而，当我们观察到中心和端粒取向的二价结构已经在变动力学中（S3A 和 S3B 图），并且它们在中期 I 通过对齐持续存在（图 3 和 4），我们发现这不太可能。此外，来自Bombyx睾丸的早期后期I细胞仍然在很大程度上显示出端粒定向的染色体，直到后期后期，这些二价细胞才“翻转”为中心向外的配置（S7图）。这些结果表明，Plodia 中期 I 的中心定向二价可能不是过渡状态（因为直到后期后期才会发生向中心外的过渡）。 无论同源物在中期I如何关联，我们惊讶地发现动粒总是朝向染色体中心形成。在飞蛾的精子发生过程中，如何定义和调节着丝粒位置还有待彻底探索。我们提出了一个高度推测的模型（图6），其中CENP-T在减数分裂前期I的早期加载了突触复合蛋白。由于CENP-T在有丝分裂细胞中具有活性基因表达的染色体区域显示出低保留率[75]，因此我们认为减数分裂中端粒-近端区域的活性转录（可能促进也可能不促进同源物识别）可能导致CENP-T从染色体远端区域丢失。在这种情况下，在染色体中心维持的 CENP-T 将继续定义中期 I 处的着丝粒位置。在这个模型中，交叉（CO）将主要发生在染色体的远端臂区域内，远离这个新定义的“着丝粒”，这与我们在中期I观察到的各种结构一致。这种机制与着丝粒附近CO的抑制一致（见[19]），并且与异染色质相比，CO更有可能在开放染色质区域形成[76,77]。如上所述，单CO与双CO可能分别导致端粒或中心定向的二价。 缩略图 下载： PPT的PowerPoint幻灯片 巴布亚新几内亚放大图片 TIFF的原始图像 图 6. 中心动力学染色体分离的推测模型。 示意图显示了飞蛾精子发生过程中配对和染色体分离的一种可能模型。在受精卵过程中，同源物聚集在富含基因的区域。同时，CENP-T沿着染色体轴组装，在那里它通过厚皮保留。在厚壁胶期间，可能发生单交叉或双交叉，分别导致形成中心定向（底部）或端粒定向（顶部）二价。无论二价取向如何，CENP-T 和其他着丝粒蛋白（如 Dsn1）都局限于染色体中心，并通过末端附着募集减数分裂纺锤体进行染色体分离。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.g006 最后，我们预测在飞蛾中期I观察到的未配对的姐妹动粒为二价的取向提供了一定的灵活性。研究表明，在鳞翅目杂交种中，倒置减数分裂（姐妹在同源物之前分离）往往更受欢迎，可能是为了防止杂交发育不良[78,79]。虽然拥有未配对的姐妹着丝粒可能会增加非整倍体的几率[45,46]，但它可能允许中期I期二价分别在非杂交或杂交情况下在双向同源物或双向姐妹之间切换，以在不同情况下保持最佳生育力。 总之，我们的数据表明，同源物识别和配对起始的机制在鳞翅目中是保守的，并且可能在更广泛的物种中是保守的，因为转录相关过程与从酵母到哺乳动物的配对有关[6,49,51,53,54]。然而，谱系特异性对全中心结构的适应导致了物种之间染色体分离的独特机制，飞蛾在精子发生过程中将着丝粒的形成限制在染色体的中心。这项工作强调了探索非模型系统中基本过程的重要性，因为使用新的生物体可以导致发现新的生物学。 方法 昆虫品系和细胞系 Savannah和Pi_bFog菌株的幼虫分别来自Erin Scully（USDA）和Arnaud Martin（GW），然后如前所述在实验室中饲养种群[37]。Bombyx幼虫是从FramsChams Panther Chameleons获得的，并如前所述饲养[35]。PiD2 细胞是 Paul Shirk （USDA） 的礼物，在 26°C 的 SF-900 ii 无血清细胞培养基 （Gibco） 中生长。 基因组和寡核苷酸设计 ch5、19 和 27 的寡绘图是使用 2021 Ag100Pest 联盟的支架水平 Plodia 基因组组装设计的 [38]。从那时起，作为同一项目（GCF_027563975.1）[39]的一部分，更新了染色体水平的组装被发布，该项目用于设计ch11和15的Oligopaints。Oligopaint库是使用Oligominer管道的修改版本设计的[80,81]。寡核苷酸被设计为具有 70-80 bp 的同源性，并且仅标记独特的单拷贝序列。将探针密度调整为每千碱基 （kb） DNA 约 1.5-2 个寡核苷酸。有关寡绘图的基因组坐标的所有信息都可以在 S1 和 S2 表中找到。寡核苷酸池购自 Twist Biosciences（加利福尼亚州旧金山）。如前所述，通过在每个寡核苷酸上添加索引条形码进行基于PCR的扩增来合成寡核苷酸[82\u201284]。 基因注释和同源图谱 我们使用 ragtag 软件 （v2.1.0） 的支架工具将旧的 Ag100Pest 支架映射到新的染色体水平组装[85]，最小唯一比对长度为 1000 bp，最小分组置信度得分为 0.5。接下来，我们通过使用 mummer 软件 （v3.23） [86] 中的工具 nucmer 生成两个组装体的全基因组比对，然后使用 mummer 工具 mummerplot 手动检查成对比对，从而验证我们选择的支架确实是完整的染色体。 新 P 的基因预测。如 https://github.com/TriLab-bioinf/LEI_ROSIN_2023 所述，通过将从GIGAdb[87]下载的Ag100Pest组装体中的现有基因注释映射到新组装体[87]上，可以制备点间组装。简而言之，mRNA序列是从获取的Ag100Pest plo_final_annotation中产生的。使用 gffread 工具 （v0.12.7） [88] 的 GFF 注释文件，然后使用 minimap2 （v2.26） [89] 和 -x splice 选项映射到新装配上。映射数据按坐标排序，使用 samtools （v.16.1） [90] 转换为 bam 格式，然后使用脚本sam_to_gtf转换为 gtf 格式。PL 和 get_genes_from_gtf。请提供。接下来，重叠至少50%长度的同链基因被标记为具有merge_genes_from_gff的同一基因的亚型。py 和 merge_overlapping_genes。PL和冗余亚型具有相同的外显子结构，用remove_redundant_transcripts去除。请提供。通过将探针域内含有注释基因的 DNA 的总碱基对除以碱基对中的探针大小（bp 基因/bp 探针）来计算给定探针结构域内的基因密度。 评估 B 之间的同步程度。森和新P。点间组装按照 https://github.com/TriLab-bioinf/LEI_ROSIN_2023 中的详细说明进行。简而言之，使用mummer工具promer在蛋白质空间中将两个基因组序列相互比对，然后使用DAGchainer软件[91]处理命中坐标，以识别两个基因组之间的同步块。在R（v4.1.1）中使用syntenyPlotteR（v1.0.0）的定制版本生成全基因组同步图[92]。 减数分裂南瓜、减数分裂分期、IF 和 DNA FISH 对减数分裂细胞的影响 对于没有IF的DNA FISH，睾丸从4第- 5第龄 Plodia 幼虫（长约 1 厘米）或 3RD- 4第龄Bombyx幼虫（>2英寸长），在1X PBS中冲洗，并在0.5%柠檬酸钠中孵育8分钟。然后将睾丸转移到硅化盖玻片上，并用 45% 乙酸/1% PFA/1X PBS 固定 6 分钟。使用聚-L-赖氨酸涂层的载玻片，然后手动压扁睾丸，并将载玻片/盖玻片在干冰上快速冷冻。用剃须刀片除去盖玻片，并将试样后固定在冷的3：1甲醇：冰醋酸中10分钟。然后将试样在1X PBS-T （0.1% Triton-X 100;PBST公司0.1）并在-20°C（70%、90%、100%乙醇，每个5分钟）下进行乙醇排，然后在室温（RT）下完全干燥。将干燥的载玻片在室温下固化约3天。干燥后，将载玻片在 72°C 下在 2xSSCT/70% 甲酰胺中变性 2.5 分钟，然后再次在 -20°C 下进行乙醇排。 将载玻片在室温下干燥 10 分钟，然后将初级 Oligopaint 探针应用于杂交缓冲液混合物中。杂交缓冲液混合物由 25% hyb 混合物（10% 葡聚糖硫酸盐/2xSSCT/50% 甲酰胺/4% 聚乙烯磺酸）、50% 甲酰胺、20% 聚乙烯磺酸和 RNaseA 组成。在用橡胶水泥将初级探针密封在盖玻片下后，将载玻片在92°C下变性2.5小时，并在37°C下转移到加湿室过夜。第二天，载玻片在 60°C 的 2×SSCT 中洗涤 15 分钟，在室温下 2×SSCT 下洗涤 15 分钟，在室温下在 0.2×SSC 下洗涤 5 分钟。然后将杂交缓冲液混合物（无RNaseA）中荧光标记的二级探针加入载玻片中，并在37°C下在加湿室中孵育2小时，然后重复上述SSC洗涤。对于通过FISH一次检查两条染色体的图像（图3C和3D），使用了荧光标记的二级寡核苷酸的不同模式。具体来说，ch5 用以下辅助标记：Arm1-alexa488、Center-atto565、Arm2-alexa647。Ch19 的标签是：Arm1-alexa647、Arm2-atto565。载玻片用DAPI染色并安装在Prolong Diamond（Invitrogen/ThermoFisher，Waltham，MA）中。在成像过程中，如前所述，根据DAPI形态和染色体/寡绘形态确定减数分裂阶段[35]。 对于睾丸压扁上的IF，睾丸在SF-900培养基中在室温下解剖，在PBS中冲洗，并在4%PFA中固定在硅化盖玻片上10分钟。固定后，在硅化盖玻片和聚-L-赖氨酸涂层载玻片之间手动挤压睾丸。然后将载玻片快速冷冻，然后取出盖玻片并在PBS中洗涤，然后用PBST洗涤0.1每次 5 分钟。载玻片在PBST中透化0.5在室温下封闭 15 分钟，然后在 PBST 的 2% BSA 中封闭0.1将一抗在封闭溶液中稀释至以下浓度，并在 4°C 下在封口膜盖玻片下的载玻片上孵育过夜。 第二天，在加入二抗进行 1 小时室温孵育之前，在 PBS-T 0.1% 中洗涤载玻片三次。洗掉二抗后，对载玻片进行DAPI染色，在PBST中洗涤三次0.1，安装在 Prolong Diamond 中，并在室温下固化至少 24 小时。然后在成像前用指甲油密封载玻片。对于具有微管蛋白或 SMC1 抗体的 IF，细胞在 PBST 后 20 分钟在室温下在 100% 甲醇中额外通透 20 分钟0.5在继续阻止之前。仅对于SMC1，封闭溶液除了0.1%Triton-X 100外，还含有0.1%洋地黄皂苷。 对于IF/FISH，洗掉二抗后，将载玻片后固定在4%PFA中10分钟，然后进行以下预变性程序：2X SSCT 10分钟室温，20%甲酰胺2X SSCT室温10分钟，50%甲酰胺2X SSCT室温（50%FM）室温10分钟，50%FM室温2小时， 92°C 时 50% FM 3 分钟，60°C 时 50% FM 20 分钟预变性后，如上所述将初级 Oligopaint 探针应用于杂交缓冲液混合物中，并使用橡胶水泥密封在玻璃盖玻片下。将载玻片在 92°C 下变性 2.5 分钟，并在 37°C 下孵育过夜。第二天，在 Prolong Diamond 中进行 DAPI 染色和镶嵌之前，完全按照上述方式应用辅助探针。 以下抗体和稀释液用于IF：兔抗Dsn1 1/1000，兔抗CENPT 1/1000和兔抗Spc24/25 1/1000（来自Ines Drinnenberg [47]的礼物），大鼠抗SMC1 1/250（来自Scott Hawley [93]的礼物），抗微管蛋白鸡尾酒（Synaptic Systems 302 209 1/500 + sigma T6074-200 1/500）。以下二抗均来自 Invitrogen，使用率为 1/500：驴抗小鼠 488 （A21202）、驴抗小鼠 555 （A31570）、驴抗小鼠 647 （A31571）、驴抗兔 488 （A21206）、驴抗兔 555 （A31572）、驴抗兔 647 （A31573）、驴抗鸡 488 （A78948） 和驴抗大鼠 647 plus （A48272）。 PiD2 有丝分裂扩散和 IF 对于有丝分裂阻滞，将colcemid（ThermoFisher）直接加入浓度为0.1ug / ml的对数期细胞烧瓶中。细胞在26°C下孵育2-3小时。 2.5x105收获细胞并重悬于0.5%柠檬酸钠中10分钟。然后使用 Shandon Cytospin 4 （ThermoFisher） 以 600 或 1200 rpm 的速度以高加速度进行涂抹 5 分钟。随后将载玻片固定在 4% PFA 中 10 分钟，在 PBST 中透化0.515分钟，并在室温下用2%BSA封闭1小时，然后如前所述对扩散进行IF[94,95]。 简而言之，一抗在 4°C 下孵育过夜（兔抗 Dsn1 1/1000）。载玻片在PBST中洗涤三次0.1在加入二抗（驴抗兔488 1/500（Invitrogen A21206））之前，将其在室温下孵育1小时。在PBST中洗涤后0.1，载玻片用DAPI染色并安装在Prolong Diamond中。 成像、定量和数据分析 使用 APO 63x/1.40 油物镜（Leica Biosystems，Buffalo Grove，IL）、Leica DFC9000 sCMOS 单色相机、EL6000 光源和 LasX 软件，在徕卡 DMi6000 宽视场倒置荧光显微镜上对睾丸南瓜上的第 5、19 和 27 章进行成像。使用 APO 63x/1.40 CS2 油物镜（Leica Biosystems，Buffalo Grove，IL）、K8 CMOS 单色相机、LED8 光源和 LasX 软件，在徕卡 DMi8 宽视场倒置荧光显微镜上对睾丸南瓜上的 Ch11 和 15 寡绘图和 PiD2 有丝分裂扩散进行成像。使用惠更斯反卷积软件（SVI，Hilversum，荷兰）或徕卡雷霆反卷积对宽场图像进行后处理。IF 和 IF/FISH 在 Stellaris 8 激光扫描共聚焦器上使用 HyD S 探测器和 Lightning 超分辨率处理（Leica Biosystems，Buffalo Grove，IL）进行成像。所有定量均手动进行。在 Prism 10 中进行统计分析。Tiff 和线扫描是在 ImageJ 中创建的。 支持信息 Plodia 基因组版本或 Plodia 和 Bombyx mori 之间的基因组比对。 显示 1/10： pgen.1011329.s001.tif 跳到无花果共享导航 很抱歉，我们无法加载您的数据。 1 / 10 下载 无花果分享 S1 图。 Plodia 基因组版本或 Plodia 和 Bombyx mori 之间的基因组比对。 2021 年用于设计 ch5、19 和 17 的 Oligopaints 的 Plodia 基因组（底部）与用于设计 ch11 和 ch15 的 Oligopaints 的 2023 年新发布的 Plodia 基因组（顶部）之间的比对。B-F） 用于设计 Oligopaints 的 2021 年 Plodia 基因组（底部）和 2023 年新发布的 Plodia 基因组（顶部）之间的染色体特异性比对，用于本手稿中分析的五条染色体。不同的颜色表示不同的同源块。染色体或支架坐标在上方和下方标明。G） 最新发布的 Bombyx mori 基因组（上）和 2023 年 Plodia 基因组发布（下）之间的比对。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.s001 （TIF） S2 图。 Bombyx 和 Plodia 配对起始和中期染色体构型的比较。 A）. 散点图显示了 Bombyx 染色体（灰色）和 Plodia 染色体（蓝色）的 Arm1：Arm2 配对起始比（X 轴）与 Arm1：Arm2 基因密度比（Y 轴）。邦比克斯“Arm1”和“Arm2”以前分别被称为“tel1”和“tel2”[35]。用于计算最佳拟合线 R 的线性回归2和 p 值。图3B所示的Plodia ch5、11、15、19和27的中期I方向量化，与[35]中7、15、16和23号染色体的Bombyx数据相比。Bombyx 染色体 7 和 15 分别与 Plodia 染色体 19 和 5 同源。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.s002 （TIF） S3 图。 在变质时，细胞显示出与端粒定向和中心定向二价一致的染色体结构。 A）. Diakinesis 亚阶段的代表性前期 I 细胞用 ch5 Oligopaints 标记。Arm1 以青色显示，Arm2 以洋红色显示。细胞 1 和 2 显示出与端粒定向的中期 I 二价一致的结构。细胞 3 和 4 显示出与中心定向的中期 I 二价一致的结构。DAPI 以灰色显示。比例尺等于 5 μm。B）. Diakinesis 亚阶段的代表性前期 I 细胞用 FISH 探针标记，可识别昆虫五聚体端粒重复序列（以绿色显示）。DAPI 以灰色显示。比例尺等于 5 μm。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.s003 （TIF） S4 图。 Plodia ch11 在减数分裂期间具有中心定位的着丝粒，但在有丝分裂期间所有染色体都是全心的。 用ch5 Oligopaints标记的代表性厚层细胞，其中两个臂探针的颜色相同（品红色），中心为黄色，如图4所示。油漆示意图如上所示。比例尺为 5 μm。虚线近似于核边。来自Plodia 5的中心定向染色体的宽场图像第用 A 所示的 ch5 寡核苷酸标记的龄幼虫睾丸南瓜和 Dsn1 IF（绿色）。DAPI 以蓝色显示。比例尺为 5 μm。绘制二价的卡通示意图显示在右侧。星号表示纺锤体极在中期I.C的位置。来自 Plodia 5 的代表性中期 I 细胞第用 ch11 Oligopaints 和 Dsn1 IF 标记的龄幼虫睾丸南瓜，显示端粒定向染色体。Oligopaints的原理图如上图所示。Arm1 和 Arm2 探针以洋红色显示，中心探针以黄色显示，Dsn1 IF 以绿色显示，DAPI 以蓝色显示。比例尺 = 5 μm。二价的卡通示意图如右图所示。星号表示主轴极。星号表示纺锤体极在中期I.D.的位置。有丝分裂中期染色体从用 DAPI（蓝色）和 Dsn1（绿色）标记的 PiD2 培养细胞扩散。比例尺等于 5 μm。插图缩放显示在右侧。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.s004 （TIF） S5 图。 Bombyx染色体在精子发生过程中也是中心动力学的。 上图：本实验中使用的 Bombyx ch15 低聚涂料示意图。下图：来自 Bombyx 5 的代表性中期 I 细胞第用 ch15 寡核酸和 Dsn1 IF 标记的龄幼虫睾丸南瓜，显示端粒定向染色体。Arm1 和 Arm2 探针以洋红色显示，中心探针以黄色显示，Dsn1 IF 以绿色显示，DAPI 以蓝色显示。比例尺 = 2.5 μm。第 2-5 列是第 1 列中绘制染色体的缩放，旋转 90 度。星号表示主轴极的方向。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.s005 （TIF） S6 图。 CENP-T 沿厚壁染色体轴定位，并在中期 I 时局限于中心区域。 代表性IF图像显示了CENP-T着丝粒蛋白在整个Plodia精子发生前期I的定位。左侧显示了所示阶段。DAPI 以洋红色显示。CENP-T以青色显示。代表性 IF 显示 CENP-T 与粘连蛋白的 SMC1 亚基沿 Plodia 厚层染色体轴的共定位。SMC1 显示为黄色。来自Plodia幼虫睾丸南瓜的代表性中期I细胞显示CENP-T着丝粒蛋白的近似中心定位（远离染色体末端）。DAPI 以洋红色显示。CENP-T以青色显示。代表性IF图像显示了Dsn1着丝粒蛋白在整个早期前期I期的定位，来自Plodia幼虫睾丸南瓜。左侧显示了所示阶段。DAPI 以洋红色显示。Dsn1 显示为绿色。来自幼虫睾丸南瓜的代表性 Bombyx 中期 I 细胞显示 Spc24/25 着丝粒蛋白（Ncd80 复合物的一部分）远离染色体末端的近似中心定位。DAPI 以洋红色显示。Spc24/25 以白色显示。左侧面板中的箭头表示缩放的染色体，如下所示。比例尺 = 5 μm（A-E）。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.s006 （TIF） S7 图。 Bombyx 染色体在早期后期 I 仍显示端粒导向的构型。 A-B） 来自 Bombyx 5 的早期 （A） 和晚期 （B） 后期 I 细胞的代表性第用 ch15 Oligopaints 和 Dsn1 IF 标记的龄幼虫睾丸南瓜。低聚涂料的原理图如上图A所示。Arm1 和 Arm2 探针以洋红色显示，中心探针以黄色显示，Dsn1 IF 以绿色显示，DAPI 以蓝色显示。比例尺 = 2.5 μm。星号表示主轴极的方向。虚线表示近似的单元格边界。C）后期染色体方向翻转模型。Arm1 和 Arm2 探针以洋红色显示，中心探针以黄色显示，Dsn1 IF 以绿色显示，纺锤体微管以蓝色显示。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.s007 （TIF） S1 表。 基于 2021 年 Plodia 基因组组装的 ch5、19 和 27 的探针坐标。 Plodia ch5、19 和 27 涂料的基因组坐标，以及涂料大小（绘制的基因组量）、寡核苷酸的探针密度和寡核苷酸的大小。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.s008 （DOCX） S2 表。 基于 2022 年 Plodia 基因组组装的 ch11 和 15 的探针坐标。 Plodia ch11 和 15 涂料的基因组坐标，以及涂料大小（绘制的基因组量）、寡核苷酸的探针密度和寡核苷酸的大小。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.s009 （DOCX） S1 数据。 最终数据文件。 用于在所有主图像和补充图像中生成图形的数据。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011329.s010 （XLSX） 确认 我们要感谢 Ines Drinnenberg 和 Scott Hawley 的慷慨抗体捐赠，感谢 Erin Scully 和 Arnaud Martin 的 Plodia 菌株，感谢 Paul Shirk 的 PiD2 细胞。我们还要感谢 Rosin 和 Lei 实验室的成员对文本的批判性阅读。最后，我们要感谢审稿人抽出宝贵时间，提供极其宝贵的意见。 引用 1.武夫 S，霍利 RS。关于其拆卸的谣言被大大夸大了：着丝粒突触复合体的秘密生活。PLoS 基因。2012;8：E1002807。PMID：22761598 查看文章PubMed/NCBIGoogle 学术搜索 2.Tanneti NS、Landy K、Joyce EF、McKim KS。果蝇卵母细胞受精卵酮期间突触起始的途径。Curr Biol. 2011;21: 1852–1857.PMID：22036181 查看文章PubMed/NCBIGoogle 学术搜索 3.Takeo S、Lake CM、Morais-de-Sá E、Sunkel CE、Hawley RS。突触复合物依赖性着丝粒聚类和果蝇卵母细胞突触的启动。当前生物学。2011;21: 1845–1851.PMID：22036182 查看文章PubMed/NCBIGoogle 学术搜索 4.克里斯托弗罗 N， 鲁宾 T， 黄 J-R.突触复合物成分促进减数分裂前生殖细胞中的着丝粒配对。PLoS 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