厦门杂志期刊论文发表=样基因整合了春化和植物年龄，以控制小麦的开花时间
胡安·德伯纳尔迪 ，丹尼尔•伍兹，李坤，李成霞，豪尔赫·杜布科夫斯基
出版日期： 2022年04月25日
抽象
植物具有调节机制，使它们能够在最大化繁殖成功的条件下开花。在农业中，选择影响这些机制的自然变异对于调节作物对特定环境的开花反应和提高产量至关重要。在温带谷物，小麦和大麦中，光周期和春化途径解释了开花时间的大部分自然变化。然而，其他途径也参与微调开花反应。在这项工作中，我们将保守的microRNA miR172及其靶标APTALA2样（AP2L）基因整合到涉及VERNALIZATION 1（VRN1），VRN2和FLOWING LOCUS T 1（FT1 = VRN3）基因的温带草开花网络中。 利用突变体、转基因和不同的生长条件，我们发现miR172促进小麦开花，而其靶基因AP2L1（TaTOE1）和AP2L5（Q）作为开花抑制因子。此外，我们发现miR172-AP2L途径调节叶片中的FT1表达，并且该调节独立于VRN2和VRN1。此外，我们表明，miR172-AP2L模块和开花都受到春季品种中通过miR156的植物年龄控制。然而，在冬季品种中，开花和AP2L1表达的调控与miR156随年龄下调脱钩，需要通过春化诱导VRN1以抑制叶片中的AP2L1并促进开花。有趣的是，miR172和两个AP2L基因的水平调节了冬季品种对不同春化处理的开花反应。综上所述，我们的研究结果表明，保守基因网络和草特有基因网络相互作用以调节开花反应，并且AP2L基因中的自然或诱导突变是在不断变化的环境中微调小麦开花时间的有用工具。
作者简介
繁殖成功对于物种生存至关重要，在栽培作物中也至关重要，以实现产量最大化。植物可以感知和整合不同的内部和环境信号，以确保在最佳条件下开花。在温带谷物，小麦和大麦中，已经进化出特定的机制，只有在植物暴露于冬季的寒冷日子之后，才能通过更长的春季来保证开花，这一过程称为春化。在这项工作中，我们表征了春化需求与将植物年龄整合到开花调节中的保守途径之间的相互作用。该途径涉及两个microRNA miR156和miR172的顺序作用。在春小麦品种中，miR156表达随着植物年龄的增加而降低，而miR172表达增加。这导致其目标的下调，APETALA2样（AP2L）开花抑制因子以及开花的诱导。然而，在冬小麦品种中，miR172的诱导和AP2L1的下调与miR156脱钩，需要通过春化诱导VERNALIZATION1基因来抑制AP2L1并促进开花。我们的结果表明，AP2L基因中的自然或诱导突变是在不断变化的环境中微调小麦开花时间的有用工具。
引文： Debernardi JM，Woods DP，Li K，Li C，Dubcovsky J （2022） MiR172-APETALA2样基因整合了春化和植物年龄，以控制小麦的开花时间。PLoS Genet 18（4）：e1010157。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157
编辑 器： Sarah Hake，“USDA-ARS Pacific West Area”，美国
收到： 一月 7， 2022;接受： 三月 20， 2022;发表： 四月 25， 2022
版权所有： © 2022 Debernardi et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。
数据可用性： 支持每个图形和每个表的所有原始数据都作为补充数据提供。
资助：J.D.感谢霍华德休斯医学研究所（HHMI研究员资助，https://www.hhmi.org/）以及来自美国农业部国家粮食及农业研究所（https://nifa.usda.gov/）的竞争性资助2022-67013-36209和2022-68013-36439（WheatCAP）的支持。J.M.D.得到了人类前沿科学计划（hfsp.org）的奖学金（LT000590/2014-L）的支持。D.P.W.是霍华德休斯医学研究所生命科学研究基金会（http://www.lsrf.org/）的研究员。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
相互竞争的利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。
介绍
精确控制开花是植物繁殖成功的核心，也是种植谷物最大化产量的核心。植物已经进化出整合各种内源和环境信号的机制，例如白天长度和温度的变化，使它们能够在优化种子生产的条件下开花。开花发生在一年中的特定时间，以响应对季节性线索的感知，例如通过称为光周期的过程改变白天或黑夜的长度[1]。温带草，包括具有重要农艺意义的作物小麦（小麦）和大麦（Hordeum vulgare L.），在春季或初夏开花，以应对较短的夜晚（较长的光周期），被称为长日（LD）植物（例如[2，3]）。许多适应温带气候的植物也具有冬季年度或两年一次的生命周期策略[4]。这些植物在秋季建立，越冬，并在春季迅速开花。这种适应性策略的关键是，在冬季之前不会开花，在此期间开花不会导致成功的繁殖。因此，这些植物已经进化出调节机制，以防止秋季开花，并感知冬天的流逝，以建立开花的能力[5]。通过长时间暴露在低温下促进开花的过程称为春化[5]。
不同植物物种开花调控网络的比较揭示了几种保守基因和基因家族，但也揭示了进化枝特异性基因[6-8]。不同的植物分支已经进化出开花网络架构，包括新的成分，基因表达模式的广泛变异和/或保守基因之间的相互作用。尽管如此，这些网络的一个共同特征是它们收敛于少数启动开花早期阶段的花卉整合基因[6]。
在温带禾本科植物中，春化和光周期途径汇聚在叶片开花位点T（FT）样基因的转录激活中[1，9]，大麦和小麦FT1位点的等位基因变异是导致艙头时间差异的原因[9-11]。FT样基因在开花过程中的核心作用似乎在开花植物中是保守的[2，12]，开花的时间在很大程度上取决于叶子中FT表达的变化。FT编码一种从叶子到芽尖分生组织（SAM）的移动蛋白质[13，14]，在那里它与bZIP转录因子FD相互作用以激活花基因并将营养分生组织转化为花分生组织[15-18]。
小麦和大麦中FT1光周期调控的主要决定因素是光周期1（PPD1或PRR37）[19]。PPD1编码具有伪受体结构域和CONSTANS，CONSTANS样，CAB表达1（CCT）结构域的定时的蛋白质，该结构域在LD条件下促进FT1表达[19]。PPD1是拟南芥（拟南芥）中草特异性重复事件（PRR37/PPD1和PRR73）的结果，该事件与拟南芥（拟南芥）的PRR3-PRR7重复无关[20]。两个拟南芥基因是生物钟的一部分，但在温带草中，PPD1在光周期通路中具有更专门的作用[19，21]。叶片中PPD1的表达受生物钟和植物色素介导的光信号通路的调节，确保PPD1在LD条件下只能促进FT1的表达[3，19，21–24]。
大麦PPD-H1编码区的突变导致非功能性或低态等位基因，在LD下诱导开花的能力降低[19]。相比之下，小麦中PPD-A1（Ppd-A1a等位基因）和PPD-D1（Ppd-D1a等位基因）同位基因启动子区域缺失导致PPD1表达增加，并且在短日（SD）下相对于祖先Ppd1b等位基因加速了头[25，26]。因此，携带Ppd1a等位基因的植物的光周期响应降低，并被指定为光周期不敏感（PI），而携带Ppd1b等位基因的植物被指定为光周期敏感（PS）[25，26]。除PPD1外，温带草还具有平行的光周期途径，涉及CONSTANS（CO）样基因CO1和CO2[22]。然而，在其他物种中，CO样基因在光周期感知中起主导作用[6，12]，而在小麦和大麦中，CO样基因具有有限的效果，在没有PPD1或PPD1功能降低时更为相关[22，27，28]。
在小麦中，FT1表达也受到春化途径的调节。目前在温带草中春化的分子模型由三个大效应位点组成，作用于调节回路，包括VRN1，VRN2和FT1（也称为小麦中的VRN3，[9]）。VRN2是一种LD开花抑制因子，它拮抗PPD1作为LD开花促进剂的作用，防止秋季在叶子中诱导FT1[29]。VRN2编码含有锌指基序和CCT结构域的蛋白质，与大米GHD7同源[30，31]，但在真双子叶植物中没有已知的同源物[29，31]。含有VRN2等位基因丧失功能的小麦和大麦植物表现出春季生长习性[29，32-35]。VRN1编码SQUAMOSA进化枝的MADS盒转录因子[36，37]，其在叶子和顶端的表达由春化诱导[36]。具有功能性但隐性vrn1等位基因的冬小麦品种需要数周的春化才能诱导VRN1并获得开花能力[36，38，39]。相比之下，携带显性Vrn1等位基因的春小麦品种（在没有低温的情况下表示）绕过了春化要求[38，40，41]。
叶片中VRN1的表达促进了VRN2的抑制[41]。因此，在春季开始时，随着日长的延长，VRN2表达水平较低，因为前一个冬天的低温诱导了VRN1，使得PPD1诱导了FT1在叶子中的表达。此外，VRN1和FT1之间的正反馈回路导致在FT1水平升高的情况下VRN1水平升高，反之亦然[42–44]。因此，在冬季植物中，VRN2在秋季对FT1的抑制保证了在植物暴露于冬季温度之前，长时间的开花促进被阻止，并且春季的正反馈循环确保了对开花的承诺（在[43]中回顾）。
除了主要的光周期和春化基因外，其他基因和通路还整合了影响开花的多种信号，例如生物钟、植物的营养和发育状态以及各种生物和非生物应激源[7，45-51]。例如，转录因子的APETALA2样（AP2L）家族（euAP2谱系）的成员已被证明可以作为开花抑制因子[52，53]。这些转录因子由两个AP2样结构域串联存在来定义，在植物中是高度保守的。它们通过整合与植物年龄和环境信号相关的信息，在调节开花过渡中起重要作用[54]。
在拟南芥中，AP2L转录因子抑制幼年植物SAM中叶片中的FT转录以及其他开花激活基因[55-57]。此外，AP2L蛋白与CO样蛋白相互作用并抑制CO活性[57]。因此，在多个AP2L成员中发生突变的拟南芥植物在LD和SD条件下都能快速开花[56，58，59]。有趣的是，在多年生物种Arabis alpina（A.alpina），拟南芥的近亲，AP2L基因PERPETUAL FLOWERING2（PEP2）是一种开花抑制剂，可控制春化反应并有助于多年生生命周期[60，61]。AP2L基因作为开花抑制因子的功能在单子叶植物中也是保守的。在玉米（Zea mays）中，AP2L基因Glossy15和EAT1的Zmtarget（ZmTOE1或与APETALA2相关。7， ZmRAP2.7）延迟开花[62，63]。在水稻（稻米）中，AP2L基因不确定的小穗1（OsIDS1）、多余的苞片（SNB）和OstOE1也起着开花抑制作用[64，65]。在小麦中，驯化基因Q（也称为AP2L5 = IDS1的小麦同源物）的功能丧失突变加速了开花[66，67]。
AP2L基因的表达在转录后水平受到miR172的调控，miR172是植物中一种古老且保守的miRNA[54]。在开花植物多样化过程中，miR172的表达在向开花过渡期间和之后增加[58，59，62，64，68-71]。在生殖组织中，miR172控制AP2L表达以调节花序和花序发育[72，73]。在小麦花序中，该调控对于控制驯化小麦穗密度、小花数量和穗状的自由脱粒特性非常重要[66，74]。
miR172对AP2L基因的抑制对于控制开花过渡的时间也很重要。MIR172基因的异位表达表明拟南芥、水稻和小麦中多个AP2L基因突变体的快速开花[56，58，64–66]。另一方面，miR172活性降低的植物，包括多个miR172位点[70，71]中的拟南芥CRISPR突变体，表达针对miR172（以下简称MIM172）或miR172抗性AP2L基因版本[56，64-66，75]的人工靶标的植物，都显示出延迟开花表型。
miR172在营养组织中的表达受环境和植物发育状态的控制[58，59，62，64，68，76-78]。随着植物年龄的增长，miR172的表达水平增加。这是一个保守网络的一部分，该网络涉及另一个名为miR156的保守miRNA，该网络控制着几个物种的幼年到成体营养相变和开花能力[76，78]。在这种所谓的植物年龄途径中，miR156在幼年阶段以高水平表达，并抑制一组SQUAMOSA-启动子结合样（SPL）基因的表达[79]。随着植物的生长，响应于糖含量的增加[80，81]，miR156表达下降导致SPL的表达增加，这反过来又激活了叶片中miR172的表达。miR172水平的升高导致AP2L基因表达受到抑制，从而促进叶片中的成虫性状和开花能力[78，82，83]。
我们之前的研究集中在miR172和AP2L基因在小麦穗发育中的作用[66，84]。在这项工作中，我们重点研究了miR172-AP2L模块通过与涉及VRN1-VRN2-FT1遗传反馈回路的温带草特定开花途径的相互作用，在调节开花过渡中的作用。结合突变体、转基因和不同的生长条件，我们发现miR172促进小麦的开花转变，而其靶向AP2L基因作为这种转变的抑制因子起作用。此外，我们表明miR172和AP2L基因在不同环境条件下调节叶片中VRN1-VRN2-FT1基因的表达并调节春小麦和冬小麦的开花反应。最后，我们描述了这些基因的突变，这些突变可能是在不断变化的环境中微调小麦开花时间的有用工具。
结果
miR172促进春小麦开花过渡
为了研究miR172在控制小麦开花转变中的作用，我们首先分析了先前在四倍体小麦品种Kronos（小麦硬质小麦亚种）中产生的miR172水平改变的转基因品系[66]（图1A）。Kronos具有由Vrn-A1c等位基因决定的春季生长习性（内含子1中的缺失），并且Ppd-A1a等位基因赋予的光周期响应减少[41]。我们选择并比较了独立 T2转基因品系过度表达任一miR172（UBI专业版：miR172） 或针对 miR172 （MIM172） 的目标模拟。通过qRT-PCR在完全扩增的第五片叶中定量miR172水平，证实UBI中miR172表达水平增加了4倍专业版：miR172植物与野生型相比，MIM172转基因植物减少了20倍（图1B和S1数据中的数据A）。
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图 1. miR172通过抑制AP2L基因促进小麦开花。
(A） 与UBI相比，六周龄的野生型克罗诺斯植物（Wt）专业版：miR172 和 MIM172 在 LD 下生长的相同遗传背景中的转基因植物。 比例尺 = 10 cm. （B） 箱形图显示 5 个中 miR172 表达水平千UBI的叶子专业版：miR172，野生型克罗诺斯（Wt）和MIM172植物在LD下生长，成熟的miR172水平通过qRT-PCR测定，以小核仁RNA 101（SnoR）为内部参考。数据对应于四个独立的生物重复。（C-D）箱形图显示了与B相同的基因型和条件中，主舵柄（C;n≥7）和主舵柄（D;n≥7）产生的叶子数量。外显子表示为深灰色框，AP2域表示为浅灰色，miR172目标位点表示为红色。TTILLING突变K3946（AP2L5）和K863（AP2L1）在基因结构上方显示，具有2个核苷酸缺失（AP2L5）和CAD161剪接突变体（AP2L1）的自然变异体在B同源体中。（F）箱形图显示野生型（Wt），仅在一个AP2L1同源物（aaBB和AAbb），AP2L1同源体（ap2l1-null = aabb），ap2l5-null突变体和apl2l1 ap2l5组合空突变体（n ≥ 8）中在LD条件下的天数。（G） 框图，显示 F 在 LD 条件下的航向天数2在AP2L-A1基因的miR172靶位点（n ≥10）中分离K4254突变的群体;Wt = 纯合野生型植物，mut = 纯合子 K4254 突变体，het = 杂合植物。野生型 miR172 靶点与 miR172 之间的相互作用如右图所示。TILLING系K4254在miR172靶位点具有G>A突变，可降低与miR172相互作用的自由能。（H-I）显示 AP2L1 在 5 中的表达水平的箱形图千野生型克罗诺斯（Wt）和三个独立的UBI的叶子（H; n = 4）和标题天数（I;n ≥5）专业版：AP2L-B1 转基因品系生长在 LD. （J-M） 野生型克罗诺斯 （Wt）， UBI 下专业版：AP2L1（转基因线#5），MIM172和MIM172 UBI专业版：AP2L-B1#5株生长在LD下（J）八周龄的植物。比例尺 = 10 cm. （K-M） 箱形图显示标题的天数 （K; n ≥ 6）、主舵柄产生的叶子数 （L; n ≥ 5） 以及 5 中 AP2L1 的表达水平千叶子（M）。箱形图上方的不同字母表示基于Tukey检验（P <0.05）的显着差异，但使用非参数Kruskal-Wallis检验的面板（D），（F）和（L）除外（S1数据中的数据A）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.g001
在LD条件下（16小时光照/ 8小时黑暗），植物过度表达miR172提前4天（图1C）并比野生型少产生0.6片叶子（图1D），而MIM172植物在8天后前进，比野生型多产生1.4片叶子（图1C和1D）。在SD条件下（8小时亮/16小时黑暗），Kronos植物在大约80天内开始（S1A和S1B图）。断续器专业版：miR172植物开花早于野生型，MIM172植物开花晚于野生型，与LD条件相似。但是，UBI之间的航向时间差异专业版：miR172和MIM172植株在SD（40天5片叶，S1A–S1C图）下大于在LD下（12天和2片叶，图1C和1D）。这些结果表明，在春小麦中，miR172在LD和SD条件下都加速了向开花的过渡。
AP2L基因突变导致开花加速
接下来，我们探讨了AP2L转录因子的作用，AP2L转录因子是miR172在调节开花时间中的已知靶标[54]。在小麦中，我们之前鉴定出四个具有miR172靶序列的AP2L基因（命名为AP2L1，AP2L2，AP2L5和AP2L7;[66，84];S1 表）。AP2L5突变体的功能丧失（图1E）显示早期开花表型[66，84]（图1F），而AP2L2的空突变体的行进时间与野生型对照没有差异[84]。我们发现了另一个AP2L基因（名为AP2L1），它与TOE1（早期激活靶标标记（EAT）1）同源，这是拟南芥和玉米中已知的开花抑制剂[58，63，84]。因此，在这项工作中，我们进一步表征了AP2L1的功能。我们在A（K863）和B（CAD0161）同源体中鉴定出具有功能丧失突变的TILLING系，并交叉它们以在Kronos中产生ap2l1-null突变体（图1E，参见材料和方法）。在LD条件下，ap2l1-null植物比野生型对照和仅在一个AP2L1同源物中具有突变的品系提前5天（图1F）。开花的加速类似于在同一腔室中生长的ap2l5-null突变体。我们还在相同的生长条件下生成并测试了ap2l5 ap2l1组合的零突变植物。组合的空突变体明显早于每个单基因空突变体，比野生型早10天（图1F）。这些结果表明，这两个miR172靶标在春小麦开花时间控制中的作用是重叠的和相加的。ap2l1-null突变体没有显示先前描述的ap2l5-null突变体的任何小穗或小花表型[66，84]（S2图）。
miR172通过抑制AP2L基因促进开花
为了研究miR172对AP2L1和AP2L5的影响，我们首先检查了这些基因在Kronos，MIM172和UBI的第五片叶子中的表达。专业版：miR172植物，使用相同的叶子样本，在图1B中显示出miR172表达的高度显着差异。有趣的是，我们没有观察到MIM172，野生型和UBI之间AP2L1表达的差异。专业版：miR172样品（S3A图），与野生型相比，MIM172中AP2L5的表达较高，但野生型和UBI之间未观察到显着差异专业版：miR172（S3B 图和 S1 数据中的数据 I）。在其他物种中也描述了类似的观察结果，其中AP2L基因的稳态转录水平在miR172水平发生变化时保持不变[58，72，85]。这些观察结果表明，miR172可以在翻译水平上控制AP2L表达[58，72]，或者AP2L蛋白可以通过反馈回路调节自己的转录本水平[55，85]。
我们通过研究在AP2L-A1同源物的miR172靶位点突变的Kronos TILLING线（K4254）进一步表征了miR172和AP2L1在开花中的作用（图1G）。该突变位于miR172靶位点内与在玉米中产生IDS1显性Taselseed6等位基因的突变相同位置[68]，并且有望减少与miR172的相互作用。我们将K4254与野生型Kronos回溯了两次，并分析了BC省LD下的航向时间1F2隔离人口。携带这种显性突变的植物比姊妹野生型植物晚3.25天（图1G和S1数据中的数据A）。这一结果与AP2L1是miR172靶向的开花抑制因子一致。
我们证实了AP2L1的开花抑制活性，转基因植物在玉米泛素启动子下构成性表达AP2L-B1基因的野生型编码区域（图1H）。三个独立的 UBI专业版与非转基因姊妹品系相比，AP2L-B1品系在航向时间上显示出显着的延迟（2.9-4.5天，图1I）。然后，我们选择了 UBI 线专业版：AP2L-B1#5具有最高的AP2L1转录本水平（图1H），并与MIM172交叉，这降低了miR172。在生成的 F 中2在LD条件下生长的种群（图1J），含有UBI的植物专业版：AP2L-B1#5或MIM172单独前进，产生的叶子比野生型多（图1K和1L）。携带两种转基因（UBI）的植物专业版：AP2L-B1和MIM172）在取向方面显示出较大的延迟（16.1天），并且与野生型对照相比，主舵柄上多产生了两片叶子，并且明显晚于单个转基因品系（图1K和1L）。
对这些品系中AP2L1表达水平的分析表明，仅携带MIM172转基因的植物与野生型相比，AP2L1表达没有差异（如S3A图中观察到的），但含有两种转基因的植物具有最高的AP2L1转录本水平（图1M）。我们假设AP2L-B1在构成性泛素启动子下的表达可能破坏了AP2L1蛋白对其自身表达的推定反馈回路，并揭示了miR172在AP2L1转录本水平上的活性。综上所述，这些结果支持miR172作为AP2L1的抑制因子和开花的促进剂的作用。
miR172和AP2L基因通过调节叶片中VRN1、VRN2和 FT1的表达来调节开花
然后，我们研究了miR172和AP2L如何与涉及PPD1和VRN1-VRN2-FT1调节环路的小麦开花网络相互作用。为此，我们使用从 Kronos 野生型 UBI 收集的叶子进行了时程表达分析。专业版：miR172和MIM172不同年龄的转基因植物在LD下生长。在3种不同基因型中，开花启动子VRN1和FT1（图2A和2B）的表达随植物年龄的增加而增加，从幼叶1（L1）到成虫叶7（L7），而随着植物接近开花，开花抑制因子VRN2的表达降低（图2C）。在第五片叶片中，我们观察到早期开花UBI中VRN1（图2A）和FT1（图2B）的表达显着更高。专业版：miR172植物比在野外类型。相比之下，在同一片叶子中，我们观察到晚开花MIM172植物中VRN1（图2A）和FT1（图2B）的表达明显低于野生型。两个VRN1相关的SQUAMOSA MADS盒基因FUL2和FUL3观察到类似的表达模式，它们在UBI的第五叶中表达较高专业版：miR172 及 MIM172 中的更低版本。对于这两个基因，野生型和MIM172之间的差异在L5中不显著，但在L7中显着（S4图和S1 Data中的Data J）。相反，PPD1在不同年龄叶片中的表达水平相似，UBI与野生型无显著差异。专业版：miR172 或 MIM172（图 2D）。
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图 2. miR172通过调节叶子中FT1的表达来控制开花。
（A-D）VRN1 （A）、FT1 （B）、VRN2 （C） 和 PPD1 （D） 的表达水平由 qRT-PCR 测定 1圣（L1）， 3第三（L3）， 5千（L5） 和 7千（L7） UBI的叶子专业版：miR172，野生型Kronos（Wt）和MIM172植物在LD下生长。数据对应于四个独立的生物重复。（E-I）野生型克罗诺斯（Wt）的种群隔离，UBI专业版：miR172、 vrn2 和 UBI专业版：miR172 vrn2 植物生长在 LD. （E） 六周龄植物下。比例尺 = 10 cm. （F-G） 箱形图显示标题的天数 （F; n ≥ 4） 和主舵柄产生的叶子总数 （G; n ≥ 4）。（H-I）箱形图显示由qRT-PCR测定的FT1（H）和VRN1（I）表达水平。ACTIN被用作内部参考。数据对应于四个独立的生物重复。（J） 九周前的 vrn1 null、 vrn1 vrn2 组合突变体和 vrn1 vrn2 UBI专业版比例尺 = 10 cm. （K-M） vrn1 vrn2 组合突变体和 vrn1 vrn2 UBI专业版：miR172 植物生长在 LD. （K-L） 箱形图中，显示标题天数 （K; n ≥ 11） 和主舵柄产生的叶子数量 （L; n ≥ 12）。（M） 箱形图显示由 qRT-PCR 测定的 FT1 表达水平，5千（L5） 和 7千（L7）叶子。ACTIN被用作内部参考。数据对应于五个独立的生物重复。箱形图上方的不同字母表示基于图基检验（P <0.05）在面板（A-D），（F）和（I），Kruskal-Wallis非参数睾丸（G）和（L）中的t检验（H），（K）和（M）（S1数据中的数据B）的显着差异。ns = 不显著，* = P < 0.05，** = P < 0.01，*** = P < 0.001。A-D中字母的颜色对应于基因型的颜色。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.g002
我们还检查了这些基因在SD条件下生长的植物的第三和第六叶中的表达（S1D-S1G Fig）。结果与LD相似，UBI专业版：miR172植物在第三和第六叶中表达显着较高的FT1和VRN1水平，较低的VRN2水平（仅L6），并且与野生型Kronos相比PPD1表达没有显着变化（S1数据中的数据H）。MIM172转基因植物在两片叶子中与野生型相比显示出相似的VRN2水平，并且在第六片叶片中VRN1和FT1水平较低，尽管差异不显着（S1D-S1G图）。综上所述，这些结果表明，在LD和SD条件下，叶片中miR172活性的组成表达与开花促进剂VRN1和FT1水平的增加以及开花抑制剂VRN2水平的降低有关。
我们还分析了来自F的植物第五片叶片中VRN1，VRN2和FT1的表达。2针对 UBI 的人口隔离专业版：AP2L-B1和MIM172在LD下生长（S5图）。与它们晚开花的表型一致，UBI专业版：AP2L-B1 MIM172植株的VRN1和FT1表达量与野生型相比降幅最大（S5A和S5B图，S1数据中的数据K），而开花抑制剂VRN2的表达显著增加（S5C图）。具有UBI的转基因植物专业版：AP2L-B1或MIM172显示所有三个基因的中间值。这些结果表明，AP2L基因通过控制这三个中心小麦开花基因的表达来抑制小麦开花。
miR172 在没有 VRN1 和 VRN2 的情况下调节 FT1 的表达
从之前的实验中，不可能确定三个基因中的哪一个受到miR172-AP2L模块的影响，因为VRN1-VRN2-FT1通过反馈调节回路相互连接。为了回答这个问题，我们首先越过了UBI。专业版：miR172株与vrn2功能丧失的Kronos突变株[32]，并分析了所得F中的开花表型2人口。在 LD 条件下，UBI专业版：miR172线现象学vrn2突变体的快速开花，包括天数到头和叶数（图2E-2G）。此外，UBI专业版：miR172 vrn2植物与单个UBI相比显示出附加的早期表型专业版：miR172 或 vrn2 植物（图 2E–2G）。我们从这些植物的第一片叶子中收集组织，以检查开花基因表达的早期反应。我们无法扩增野生型或UBI中的FT1转录本专业版：miR172第一个叶片样本，但我们在vrn2突变体中检测到低FT1表达水平（图2H）。有趣的是，UBI专业版：miR172 vrn2与vrn2突变体相比，FT1表达显著增加（图2H）。在所有品系中均检测到VRN1表达，野生型，UBI之间未观察到差异专业版：miR172 和 vrn2 样本。然而，VRN1在UBI中的表达显着更高。专业版：miR172 vrn2 植物（图 2I）。这些结果表明，在没有VRN2的情况下，miR172的过表达可以促进FT1和VRN1的表达。
由于FT1和VRN1也可以在正反馈回路[9，17，42，50，86]中相互调节，我们还引入了UBI专业版：miR172 转基因到 vrn1 vrn2 突变背景 [41] 以进一步剖析这些相互作用。在VRN1（vrn1）中具有功能丧失突变的植物不能抑制VRN2表达，并且具有非常延迟的头部[41]（图2J）。vrn1 vrn2突变背景中VRN2的消除加速了开花过渡[41]（图2J）。有趣的是，UBI专业版：miR172 vrn1 vrn2 植物平均比 vrn1 vrn2 早 8 天，并少生产一片叶子（图 2J–2L），表明 UBI专业版：miR172可以在没有VRN1和VRN2的情况下促进开花。我们从这些植物的第五和第七片叶子中收集了组织，并测量了FT1 mRNA水平。与快速开花一致，我们观察到UBI第七片叶子中FT1表达显着增加专业版：miR172 vrn1 vrn2 与 vrn1 vrn2 植物相比（图 2M）。综上所述，这些结果表明，miR172可以通过调节叶片中的FT1表达来促进开花，而与VRN1和VRN2无关。
miR156通过调节miR172和AP2L1表达来调节小麦开花时间
接下来，我们研究了上述 miR172-AP2L 模块与开发调节的 miR156 之间的连接。在LD条件下生长的野生型Kronos叶子的时程实验显示，第一和第三叶的miR156水平较高，随后在成虫第五和第七叶中下调（图3A）。在相同的样品中，成熟的miR172水平随着植物年龄的增加而增加，与miR156的趋势相反（图3B）。这些模式与其他物种观察到的模式相似[76，78，83]，表明与年龄相关的miR156-miR172途径在小麦中是保守的。
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图 3. miR156的过表达延缓了小麦的开花过渡。
(A-B）箱形图显示了由 qRT-PCR 测定的 miR156 （A） 和 miR172 （B） 的表达水平，在 1圣（L1）， 3第三（L3）， 5千（L5） 和 7千（L7）在LD下生长的野生型Kronos植物的叶子，SnoR被用作内部参考。数据对应于四个独立的生物重复。（C-N）断续器专业版：LhG4 （LhG4）， pOp：miR156 和 UBI专业版：LhG4/pOp：miR156 植物生长在 LD. （C） 六周龄植物下。比例尺 = 10 cm. （D） 箱形图显示由 qRT-PCR 测定的 miR156 表达水平，9千叶。数据对应于六个独立的生物重复。（E-F）箱形图显示到穗的天数（E; n ≥ 6）和主舵柄在过渡到穗之前产生的叶子数量（F; n ≥ 6）。（G-N）箱形图显示了由qRT-PCR测定的FT1（G），FUL2（H），FUL3（I），VRN1（J），VRN2（K），miR172（L），AP2L1（M）和AP2L5（N）的表达水平，在9中由qRT-PCR测定千叶。ACTIN用作FT1，FUL2，FUL3，VRN1，VRN2，AP2L1和AP2L5的内部参考，SnoR用于miR172。数据对应于六个独立的生物重复。不同的字母表示Tukey测试中的显着差异（P <0.05），除了使用非参数Kruskal-Wallis成对测试的面板（F）（S1数据中的数据C）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.g003
为了研究miR156对小麦miR172-AP2L模块调控的作用，我们首先生成了表达组成性高水平miR156的转基因植物。我们在四倍体小麦中鉴定出每个基因组5个位点，这些位点编码miR156前体序列，这些前体序列可以被潜在地处理以产生成熟的miR156序列（S2表）。我们决定克隆并过表达miR156b，c位点，该位点已在几种单子叶植物中进行了研究[87]。有趣的是，来自水稻，玉米和短吻鲈的miR156b，c位点包括两个串联表达的前体，而麦类物种含有额外的前体，因此小麦miR156b，c位点包括三个串联的前体（S6A图）。
使用玉米泛素启动子对四倍体Kronos中B基因组miR156b，c位点的过表达导致T0如前所述，产生许多分蘖并具有浓密外观的植物（S6B图），[88]。然而，这些植物是无菌的，没有凝固谷物。为了产生稳定的转基因品系过表达miR156，我们使用LhG4/pOp双组分系统（[89];详见材料和方法）。在这个系统中，miR156只有在穿过含有UBI的工厂后才被过度表达。专业版：LhG4 与包含 pOp：miR156 结构的那些（图 3C）。与 F 相比1仅包含其中一个结构的工厂，F1 断续器专业版：LhG4/pOp：miR156植物表示miR156含量高（图3D），需要多出10天（图3E），并且比对照组平均多生产8片叶子（图3F）。UBI的延迟开花专业版：LhG4/pOp：miR156植株与FT1、FUL2和FUL3表达的显著降低（图3G–3I）、成熟miR172表达的显著降低（图3L）以及AP2L1水平的升高（图3M）相关。VRN1、VRN2和AP2L5的表达水平不受miR156过表达的影响（图3J、3K和3N）。
为了补充对过表达miR156的转基因系的分析，我们生成了表达目标模拟物的转基因系，以减少miR156在体内的活性（MIM156）（图4A）。我们在Kronos中生成了四个独立的MIM156品系，这些品系具有较低水平的miR156（图4B），并在LD条件下表征了它们的开花表型。MIM156植物提前4天（图4C）出头，比非转基因姊妹系（图4D）少产生1-2片叶子，表明早期过渡到生殖发育。然后，我们检查了野生型第一，第三和第七片叶子和在LD条件下生长的MIM156#2植物中开花基因的表达。与早期开花一致，MIM156#2植物的第三片叶子表现出较高的FT1（图4E）和VRN1（图4F）水平，以及较低水平的VRN2（图4G）。
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图 4. 转基因靶标模拟MIM156诱导开花促进基因的表达并加速艉头时间。
（A） 五周龄野生型克罗诺斯（Wt）和T型1比例尺 = 10 cm. （B） 箱形图显示了由 qRT-PCR 测定的 miR156 在 1 中测定的表达水平圣野生型克罗诺斯植物的叶子（L1）和T1在LD. SnoR下生长的四个独立MIM156品系的植物被用作内部参考。数据对应于四个独立的生物重复。（C-D）箱形图显示了野生型克罗诺斯（Wt）和四个独立的MIM156 T的天数（C;n ≥4）和主舵柄产生的叶子数量（D;n ≥4）1LD.（E-I）箱形图下生长的线，显示了FT1（E），VRN1（F），VRN2（G），miR172（H）和AP2L1（I）的表达水平，由qRT-PCR测定1圣（L1）， 3第三（L3） 和 7千（L7）野生型克罗诺斯（Wt）和MIM156#2的叶子在LD下生长。作为内部参考，我们将ACTIN用于FT1，VRN1，VRN2和AP2L1，SnoR用于miR172。数据对应于四个独立的生物重复。箱形图上方的不同字母表示基于图基检验在B和D中的显着差异以及图C中的Kruskal-Wallis检验（P<0.05）。面板E-I的差异基于t检验（S1数据中的数据D）。ns = 不显著，* = P ≤ 0.05，** = P ≤ 0.01，*** P ≤ 0.001。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.g004
我们假设MIM156植物的部分快速开花表型是由miR172的诱导介导的。为了与这一假设一致，我们在MIM156植物的第三和第七片叶子中观察到更高水平的miR172（图4H），以及第七片叶子中AP2L1表达的减少（图4I）。此外，我们杂交了MIM156和MIM172转基因植物，并分析了F的开花表型。2人口。正如预期的那样，MIM156 MIM172植物后来比单个MIM156植物产生更多的叶子（S7A和S7B图和S1数据中的数据L）。然而，与单个MIM172相比，MIM156仍然可以在MIM172存在下加速开花（S7A和S7B图）。
综上所述，这些结果表明，miR156延迟了小麦的开花，部分原因是通过调节miR172和AP2L1表达。
AP2L1的抑制与冬小麦植株miR156的年龄控制下调脱钩
先前的结果表明，miR156水平影响miR172和AP2L1在叶片中的表达，进而调节春小麦品种的开花过渡。然而，在春季品种中，开花过渡发生得很快，很难区分植物年龄（miR156）和开花诱导对miR172-AP2Ls模块的个体影响。因此，我们研究了冬小麦植物开花过渡期间的miR156-miR172途径，这需要长时间暴露在低温下才能引起快速开花。为此，我们使用了Kronos TILLING品系，该品系在春季VRN-A1等位基因中具有功能丧失突变，并且具有功能性冬季vrn-B1等位基因，因此这些植物具有冬季生长习性（[41]，以下简称“冬季Kronos”）。这些品系显示随着春化处理的增加而加速的艏头时间和减少的叶数，这种反应在春化6周后饱和（S8A和S8B图和S1数据中的数据M）。
首先，我们对从没有寒冷的LD下生长的不同年龄的春冬季Kronos植物的叶子中进行了详细的时程表达分析。在这种情况下，冬季植物需要比春季姊妹线多约100天才能到达头部（S9A和S9B图和S1数据中的数据N）。在春季植物中，VRN2的表达显着下调，而FT1和VRN-B1转录本水平在第七片叶中诱导（L7;W5 = 5周龄的植物）与第一片叶子（L1;W1 = 1周龄的植物），与它们的早期开花一致（图5A-5C）。相比之下，VRN2的表达在5至10周龄的冬季植物中保持高水平，然后缓慢下降，直到在已经长出旗叶的18周龄植物中达到非常低的水平（图5A）。VRN2的下调伴随着14至18周之间FT1和VRN-B1的诱导（图5B和5C）。
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图 5. 春化和VRN1表达对春小麦和冬小麦开花基因miR156和miR172转录水平的影响。
（A-F）在没有春化处理的情况下，在LD条件下生长的春季（橙色）和冬季（蓝色）Kronos植物的叶子中，通过qRT-PCR确定的时间过程表达水平。W1 = 第 1 周，第 1 周圣叶;W5 = 第 5 周，第 7 周千叶;W10 = 第 10 周，第 10 周千-11千;W12 = 第 12 周，第 13 周千-14千;W14 = 第 14 周，第 15 周千-16千;W16 = 第 16 周，第 18 周千-19千;W18，第18周，旗帜叶（20千-23第三).在两种基因型中，完全扩增的7千在5期间收集了叶子千周。然而，叶子样本没有在同一天收集（春季为34天，冬季为种植后36-38天）。ACTIN被用作（A）VRN2，（B）FT1，（C）VRN1和（F）AP2L1的内部参考，以及（D）miR156和（E）miR172的SnoR。* = P < 0.05，** = P < 0.01，*** = P < t 检验（A，D-F）和非参数 Kruskal-Wallis 检验（B 和 C）中的 P < 0.001，比较春季和冬季 Kronos 植物在同一片叶片上的表达。（G-K）箱形图显示了由 qRT-PCR 测定的 VRN2 （G）、FT1 （H）、miR156 （I）、miR172 （J） 和 AP2L1 （K） 的表达水平，在 7千冬季克罗诺斯植物的叶子没有春化，和7千冬季克罗诺斯和vrn1-null突变体的叶子被春化8周，然后移动到室温两周。来自 7 的样品千当叶子完全膨胀时，叶子被收集。ACTIN被用作VRN2，FT1和AP2L1的内部参考，以及miR156和miR172的SnoR。数据对应于至少5个独立的生物重复。在图-K面板中，箱形图上方的不同字母表示Tukey检验中存在显著差异（P <0.05），但窗格（H）除外，其中使用了非参数Kruskal-Wallis检验（S1 Data中的数据E）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.g005
我们观察到成熟的miR156在春季和冬季植物的幼叶（W1）中以相似的水平表达，然后在具有两种生长习性的植物的第七叶（W5）中将其表达抑制到相似的水平（图5D）。有趣的是，miR156表达在冬季植物的后期叶子中继续显示出逐渐下调。
在W1和W5之间，miR172水平在春季和冬季Kronos中都有所增加，但在春季线（接近航向）中达到明显高于冬季线的水平（图5E）。相比之下，与W5处的春季植物相比，冬七叶AP2L1的表达水平显著高于春花（图5F）。
在冬季品系中，我们观察到miR172的表达随着年龄的增长而逐渐增加，直到第16周（图5E）。有趣的是，在W5之后，我们没有观察到AP2L1（图5F）和AP2L5（S9C图）的转录本水平的平行下调。这个结果类似于UBI的有限效果。专业版：miR172 在 S2A 和 S2B 图中描述的 AP2Ls 脚本级别上。在W14之后，我们观察到AP2L1和AP2L5的突然下调，与FT1（图5B）和SQUAMOSA基因VRN1（图5C），FUL2和FUL3（S9D和S9E图）的上调相吻合。
对于图5A–5F（S1数据中的数据E）和S9D和S9E图（S1数据中的数据N）中的所有基因，发育过程中基因表达差异的方差分析对于春季和冬季系均具有显着性，证实了所有这些基因都受到发育调节。只有AP2L5（S9C图）显示弹簧线没有显着差异，冬季线只有轻微显着差异（P = 0.05）。此外，在图5A–5F（S1数据中的数据E）和S9D-E（S1数据中的数据N）中，W5的弹簧线与W18的冬季线之间未检测到基因表达的显着差异，这表明两种基因型在航向时间的调节相似。
AP2L1的下调与SQUAMOSA MADS-box基因的上调相关，与拟南芥中报道的SQUAMOSA MADS-box基因对AP2L基因的负调相关[70，90]。类似的法规也可以解释在弹簧Kronos线的W5处观察到的AP2L1（和miR172的感应）的快速抑制。为了进一步探索这一假设，我们研究了AP2L1和miR172在春化冬季克罗诺斯和vrn1-null突变植物中的表达[41]。我们将2周龄的冬季植物春化8周，并在植物从寒冷中取出两周后从非春化和春化的冬季植物中收集L7样品。VRN2的表达在恢复到室温后2周在春化的冬季植物中仍然受到抑制，但在vrn1-null突变体中没有，与先前的发现一致[41]（图5G）。FT1（图5H），VRN-B1，FUL2和FUL3（S9G-S9I图）的表达仅在具有功能性VRN1等位基因的春季冬季植物中诱导。miR156的表达没有被春化处理修饰（图5I），但与未春化冬季和春化vrn1-null植物相比，我们观察到春化冬季植物中miR172表达的诱导（图5J）。此外，与vrn1-null突变体相比，两株从春化处理中恢复到室温后，冬植株AP2L1的表达显着下调（图5K）。
综上所述，在冬季植物叶片中，miR156表达随株龄的下调与AP2L基因表达的下调脱钩，通过春化诱导VRN1促进了miR172的上调和AP2L1的抑制。
miR172可调节暴露于不同春化处理的冬小麦植株的开花时间
接下来，我们探讨了miR172-AP2L模块在冬小麦植物开花过渡中的作用。为此，我们转移了UBI专业版：miR172和MIM172转基因进入冬季Kronos背景，并评估了在LD条件下生长而不春化的植物的开花时间，或者在植物达到第二叶期后春化2，3和6周的植物的开花时间。
在没有春化的情况下，冬季植物平均需要170天才能头部，并在主舵柄上产生25片叶子（图6A和6B）。在这种情况下，冬季MIM172和vrn1-null与冬季植物相似，而冬季UBI专业版：miR172生产线在120天后（提前50天）开始，并产生了18片叶子（图6A和6B）。各基因型的天数和叶数显示出相似的剖面，表明标题时间的差异是由于营养期和生殖期之间花卉过渡时间的发育差异，而不仅仅是由于过渡后茎的伸长率差异。经过6周的春化，这是冬季Kronos（S8A和S8B无花果），冬季UBI的饱和春化处理专业版：miR172，冬季MIM172和冬季Kronos植物迅速发展（33至39天），并显示出相似的叶数（9至9.5片叶子），品系之间只有很小的差异（图6A和6B）。在相同的6周冷处理下，vrn1-null植物对春化的反应较弱，在136天后发芽，并产生24.3片叶子，与先前的发现一致[41]。
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图 6. miR172水平调节冬小麦植物的开花反应。
(A-B）箱形图显示主舵柄 （B） 的天数 （A） 或主舵柄 （B） 中的叶数，用于 vrn1-null、冬季 Kronos、冬季 MIM172 和冬季 UBI专业版：miR172植物在LD条件下生长，无春化（NV），具有2（2WV），3（3WV）和6（6WV）周的春化（n ≥ 6）。（C-H）miR172 （C）、AP2L1 （D）、AP2L5 （E）、VRN1 （F）、FT1 （G） 和 VRN2 （H） 的表达水平由 qRT-PCR 测定 9千叶的 vrn1-null、冬季 Kronos、冬季 MIM172 和冬季 UBI专业版：miR172植物在没有春化处理的情况下在LD条件下生长，并且在春化3（3WV）和6（6WV）周后生长。春化后，将植物移至室温25天，然后完全膨胀9千收集了叶子。SnoR被用作miR172的内部参考，ACTIN被用作其他基因的内部参考。数据对应于四个独立的生物重复。箱形图上方的不同字母表示在每次春化处理中进行的Tukey测试中存在显着差异（P <0.05），但使用非参数Kruskal-Wallis测试的面板（B）2WV除外（S1 Data中的数据F）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.g006
为期两周的亚饱和春化处理加速了生殖过渡，冬季Kronos在125天后产生21.7片叶子，冬季UBI专业版：miR172线在81.5天后产生15.3片叶子（图6A和6B）。为期两周的春化处理使冬季克罗诺斯（-39.5天和-3.83叶）和UBI的艙头时间加快，叶数减少专业版：miR172（-37.3 天和 -3.3 叶）比 MIM172（-19.7 天和 -1.2 叶） 多。当植物暴露于三周的亚饱和春化处理时，观察到类似的趋势（图6A和6B）。有趣的是，MIM172冬季植物在两种亚饱和春化处理下与vrn1-null植物的开花时间相似。两种性状在阶乘ANOVA中高度显著的基因型x春化相互作用中反映了开花差异（P <0.001，S1 Data中的数据F）。即使我们从分析中删除了vrn1-null基因型，这种相互作用仍然非常显着（S1 Data中的P<0.001 Data F）。该结果证实，miR172在冬小麦亚饱和春化处理下调节开花响应。
为了进一步表征春化与miR172之间的相互作用，我们在植物从寒冷中取出25天后收集了第九片叶子并进行了基因表达分析。冬季Kronos和vrn1-null植物6周叶片中miR172水平的比较显示，仅在具有功能性VRN1等位基因的植物中诱导表达miR172（图6C），与春化8周后的先前结果一致（图5J）。然而，3周的部分春化处理不足以诱导miR172水平，其在冬季Kronos和vrn1-null植物的叶子中显示出相似的水平（图6C）。
UBI的异位表达专业版冬季植物中的miR172在所有三种春化处理中都导致miR172水平较高，但在春化6周后最高（图6C）。MIM172系即使在春化6周后也显示出较低的miR172表达水平。在这些条件下，miR172表达的变化与AP2L表达的变化呈负相关。MIM172工厂中miR172水平升高导致AP2L1水平降低，MIM172工厂miR172水平降低导致AP2L1和AP2L5水平升高（图6D和6E）。请注意，NV和3WV叶片中AP2L1的表达水平比AP2L5高出一个数量级以上。
我们还量化了相同样品中开花基因VRN1，FT1和VRN2的表达（图6F-6H）。VRN1和FT1均显示表达逐渐增加，与春化处理的持续时间相关，在感冒6周后观察到最高值（图6F和6G）。有趣的是，在春化3周后，冬季UBI专业版：miR172植物的FT1和VRN1水平显着较高，而冬季MIM172在这两个基因中表达较低的水平。经过6周的春化，冬季克罗诺斯，冬季UBI专业版：miR172和冬季MIM172植物的VRN1水平相似，而FT1在UBI中仍然显着更高专业版：miR172，在 vrn1-null 植物中不诱导。VRN2观察到相反的趋势，其中表达水平随着寒冷时间的增加而降低，但vrn1-null植物除外，其显示出构成性VRN2表达（图6H）。正如预期的那样，冬季UBI的VRN1转录本水平更高专业版：miR172植物在春化3周后与低于冬季克罗诺斯的VRN2 mRNA水平相关。然而，经过6周的春化，VRN2在冬季克罗诺斯被抑制到类似的水平，冬季UBI专业版：miR172和冬季MIM172（图6H）。
AP2L1和AP2L5在亚饱和春化处理冬小麦开花时间的调节中起重要作用
为了测试miR172对冬小麦春化开花响应的影响是否由其对AP2L基因的抑制介导，我们将ap2l5和ap2l1突变与冬季Kronos系杂交，并评估了没有春化或2周亚饱和的春化处理的艉头时间（图7）。在这两种情况下，单个ap2l5和ap2l1突变体都提前了39至57天，比冬季植物的叶子少了5.5至7.7个，并且与冬季UBI相似。专业版：miR172转基因植物（图7A和7B）。ap2l1突变体比ap2l5突变体稍早（10-14天），叶子（1.7-1.8个叶）（图7A和7B）。比ap2l5突变体少。
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图 7. AP2L1和AP2L5基因调节冬季植物的开花反应。
(A-E）冬季克罗诺斯，冬季 UBI专业版：miR172，冬季ap2l1，冬季ap2l5和冬季ap2l1 ap2l5在LD条件下生长，没有春化（NV）并且春化2（2WV）周。显示（A）天数到头或（B）主舵柄中的叶子数的箱形图（n≥6）。（C-E）通过 qRT-PCR 测定的 VRN1 （C）、FT1 （D） 和 VRN2 （E） 的表达水平在 9千叶。春化后，将植物移至室温25天，然后完全膨胀9千收集了叶子。ACTIN被用作内部参考。数据对应于四个独立的生物重复。箱形图上方的不同字母表示Tukey测试中的显着差异（P <0.05），但使用非参数Kruskal-Wallis测试的面板（B）2WV和（D）NV除外（S1数据中的数据G）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.g007
冬季ap2l1 ap2l5联合突变体在没有春化（102天和16.8片叶子）或部分春化（70天和14.3片叶子）时，相对于所有其他基因型，显示出最早的头和最少的叶子数量，并且在这两种情况下，它比冬季UBI更早，叶子更少专业版：miR172植物（图7A和7B）。值得注意的是，非春化ap2l1 ap2l5突变体仍比完全春化的冬季克罗诺斯植物或非春克罗诺斯晚两个月，表明ap2l1 ap2l5突变体减少但并未取消小麦的春化要求。
与开花速度较快一致，非春化ap2l1和ap2l1 ap2l5突变株的VRN1和FT1水平明显高于冬季对照。这些差异在春化两周后保持，但仅对FT1显着（图7C和7D）。VRN2在突变体中的表达降低，但差异不显著（图7E）。我们没有观察到ap2l5突变植物的VRN1和FT1水平升高或VRN2水平降低，尽管它们的早期标题和相对于冬季对照的叶数减少。然而，由于ap2l5的头部略晚于其他两个突变体（图7A和7B），我们不能排除在采样点之后表达的类似变化。
最后，我们结合了 MIM172 和 UBI专业版：AP2L-B1转基因在冬季克罗诺斯背景。我们预计MIM172和UBI专业版：AP2L-B1，以响应春化处理延迟开花;因此，我们在4周的部分春化实验下分析了后代，这更接近饱和的6周春化处理。MIM172工厂的航向相对于冬季Kronos线延迟，但MIM172和冬季Kronos都早于vrn1-null工厂（S10图和S1 Data中的Data O）。有趣的是，冬季植物同时含有MIM172和UBI。专业版：AP2L-B1晚于MIM172工厂，并且与vrn1-null工厂的时间相似（S10图）。
综上所述，这些结果表明，在冬小麦品种中，miR172和AP2L基因的水平会影响诱导VRN1，VRN2和FT1基因表达变化所需的冷暴露持续时间，这反过来又可以调节对亚饱和春化条件的开花反应。
讨论
AP2L基因作为开花抑制剂起作用
在这项工作中，我们结合使用遗传，转基因和表达分析来证明miR172-AP2L模块通过与春化途径的中心参与者的相互作用，在小麦开花时间的调节中起重要作用。
AP2L蛋白是转录因子，可作为几种物种开花过渡的抑制因子，包括拟南芥等真双子叶植物和水稻等单子叶植物[54]。在这些物种中，AP2L基因家族包括几个成员，这些成员通常在开花过渡的调节中具有重叠的作用。例如，拟南芥含有六个AP2L基因（TOE1，TOE2，TOE3，SCHLAFMUTZE（SMZ），SCHNARCHZAPFEN（SNZ）和AP2），之前的一项研究表明，toe1 toe2双突变体比任何一个突变体开花的时间都早，但仍然不如35S那么迅速开花。专业版：miR172 过快线 [58]。最近的一项研究表明，toe1 toe2 smz snz toe3-1 ap2-12 六胞胎突变体表象35S专业版：miR172 植物非常接近 [55]。
我们的工作还表明，AP2L1和AP2L5基因在小麦开花过渡的控制中具有重叠的作用，单一和组合ap2l1 ap2l5突变体在春季和冬小麦的姊妹野生型系开花时间较早。ap2l1 ap2l5突变体早于单个突变体和UBI专业版：miR172 转基因植物。UBI的相对温和的影响专业版：miR172关于航向时间可能是我们选择具有弱小花表型的可育转基因品系的间接影响，该表型可能表达转基因的中间水平。在我们之前的研究中，Kronos中miR172的强烈过表达导致小花缺陷和无法繁殖的不育植物[84]。
AP2L5除了对开花时间有影响外，还影响花序和花序发育，与ap2l2突变体结合时，ap2l5突变体缺陷被放大[84]。然而，ap2l1突变体发展出正常的花序（S2图）。在拟南芥中也描述了类似的观察结果，TOE1（AP2L1的同源物）和TOE2影响开花时间，AP2（更接近AP2L2 [84]）调节开花时间和花发育[55，58，72]。这些结果表明，这两个AP2L进化枝的古老亚功能化在拟南芥和小麦中仍然存在。
AP2L转录因子控制开花的机制在拟南芥中得到了最好的描述。染色质免疫沉淀分析显示，TOE1和SMZ蛋白可以与FT启动子序列结合并抑制其在叶片中的表达[56，57]。此外，这些全基因组实验表明，SMZ和AP2抑制了许多其他作用于FT下游的叶子和SAM的开花时间调节剂[55，56]。除了对FT和其他开花基因的直接转录调控外，TOE蛋白还被证明可以抑制拟南芥中的CO活性[57]，因为它们可以与CO的转录激活结构域相互作用并影响CO蛋白稳定性。同样，我们的研究结果表明，miR172可以通过抑制AP2L基因诱导叶片中的FT1表达，并且这种机制与VRN1和VRN2无关，或PPD1表达的变化无关。然而，我们目前不知道FT1的这种转录调控是由间接效应引起的，还是由AP2L蛋白与FT1调节序列的直接结合介导的。
AP2L基因对不同光周期下春小麦和冬小麦开花的多分贡献
VRN2和AP2L基因是开花的抑制因子，可能通过抑制叶子中的FT1转录起作用。然而，消除UBI中两种类型的FT1抑制基因专业版：miR172 vrn2 vrn1 植物的开花速度没有达到在含有春季 Vrn1 等位基因的背景中观察到的相同程度 [UBI专业版：miR172 vrn2 vrn1： ~55 天 （图 2K） vs.断续器专业版：miR172 vrn2 Vrn1： ~35 天 （图 2F）]。该结果表明，VRN1可以独立于VRN2和AP2L基因加速开花。这可以通过直接调节叶片中的FT1来介导，该假设得到了VRN1促进vrn2-null植物叶片中FT1表达的支持[42]，以及VRN1与FT1启动子在大麦CHIP-seq实验中的结合[86]。此外，即使没有FT1 ̧，VRN1也被证明可以促进SAM在营养期和早期生殖阶段之间的转变，但FT1表达在后期阶段对于正常的穗状发育和茎伸长仍然是必需的[91，92]。
VRN2和AP2L基因对小麦开花抑制作用的相对贡献取决于遗传背景。在春季品种中，这两种途径对抑制开花和UBI的贡献相似专业版：miR172 vrn2植物表现出加性效应，开花非常迅速（图2）。然而，在没有春化的情况下生长的冬季品种中，VRN2起着更主要的作用，因为vrn2 vrn1植物在65天内开花，而UBI专业版：miR172 vrn1 需要 120 天才能开花。VRN2的突出作用也得到了以下观察结果的支持：在二倍体小麦和大麦中，用于春季生长习性的主要QTL已被映射到VRN2的多个功能丧失等位基因[29，35]。结果表明，尽管miR172和AP2L基因在抑制非春化冬植株开花方面的作用比VRN2更有限，但它们在非饱和春化条件下可以调节开花响应。
AP2L基因与春化之间的相互作用也在多年生芸苔属物种A中进行了描述。阿尔皮纳。在该物种中，拟南芥AP2 [60，61]和TOE2 [93]的直系物调节对春化的年龄依赖性反应，并有助于常年生长习性。然而，而A.AP2的alpina同源物足以赋予春季生长习性[60，61]，冬小麦植株过度表达UBI专业版：miR172或携带ap2l1 ap2l5突变显示出减少但仍然很强的春化需求（图6A，6B，7A和7B）。这些观察结果证实了AP2L基因作为开花抑制因子的保守作用，并表明它们对春化需求的相对贡献可能因物种而异。
结果还表明，miR172-AP2L模块在SD下调节Kronos开花时间，并且效果比LD下更强（图1和S1）。在玉米中，一些品种表现为SD植物，一个主要的开花时间QTL，称为营养到生成过渡1（Vgt1），被映射到位于ZmTOE1上游70 kb的2-kb保守非编码区域[63]。Vgt1作为顺式作用调节元件，影响玉米ZmTOE1的转录本表达水平和开花时间。有趣的是，最近发现的小麦1BS染色体上的短日开花时间响应QTL也与AP2L-B1（TaTOE1）有关[94]。由于AP2L-B1突变等位基因与早期开花有关，作者认为AP2L-B1可能作为开花抑制剂，这与这里提出的结果一致。
这些天然AP2L1等位基因，以及这项工作中产生的突变等位基因，为小麦育种者提供了额外的工具，可以根据特定环境微调小麦开花时间。
叶片春化和植物年龄控制miR172和AP2L表达
miR156-SPLs和miR172-AP2Ls是植物中的两个保守的miRNA模块，它们在芽中与植物年龄一起表现出互补的表达模式[78，82，83]。结果显示，miR156和miR172在春小麦中的互补表达模式相似。在miR156活性降低的MIM156植物中，miR172在幼叶中表达较高（图4），而过度表达miR156的植物的成年叶具有较低水平的miR172和较高水平的AP2L1（图3）。这些结果表明，miR156对于miR172和AP2L1的正确表达模式是必需的。然而，这些相互作用在冬小麦背景中被改变。虽然miR156在春季和冬季品种中的表达谱相似，但miR172的表达在两种背景之间有所不同。在春季植物中，miR172表达在开花过渡后的早期阶段迅速增加，达到高水平，而与春小麦相比，冬小麦随着年龄的增长而增加。这些结果表明，miR156和miR172-AP2Ls模块是连接的，但其他机制也可以调节miR172下游miR172的表达谱。
我们推测，在开花过渡的诱导过程中，几个反馈回路的作用是加强基因表达的变化，并在发育程序中产生强大的转变。将冬季植物春化数周可促进miR172的快速诱导和AP2L1的下调，类似于春季品种中观察到的。有趣的是，在多年生芸苔属A中观察到类似的结果。阿尔皮纳。在该物种中，miR156的积累在较老植物的芽尖中减少，这些植物在长时间内获得开花的能力，但miR172表达较低。需要春化来诱导开花并促进芽尖miR172水平的增加[61]。
这项工作的另一个有趣的观察结果是，即使在miR172表达增加时，在冬季植物中，AP2L1表达也不会随着植物年龄的下调。已经证明，miR172水平可以降低AP2L蛋白水平而不影响转录本水平[58，72]。有人提出，miR172可能会抑制AP2L mRNA的翻译[58，72]，或者涉及AP2L基因控制自身转录的反馈回路可以保持转录本水平恒定[85]。然而，通过春化（图5和6）或在未春化生长的晚开花冬季植物的旗叶中下调AP2L1表达（图5）表明，小麦中也可能存在抑制AP2L基因表达的其他机制。
最近一项针对拟南芥的研究表明，在花序发育过程中，FUL直接抑制与miR172平行的几种AP2L基因的转录，如SNZ、TOE1和AP2[90]。另一项拟南芥研究表明，FUL和miR172在转录和转录后水平上控制AP2L基因活性，以促进花的转变[70]，这可能提供一种快速而强大的机制，随着开花的进行，AP2L基因的消耗。小麦似乎也是如此，冬小麦品系的春化导致AP2L1的下调，但仅与活性VRN1基因一致。与具有功能性VRN1等位基因的春化植物相比，春化vrn1-null植物中AP2L基因的高水平表明VRN1在AP2L1的转录下调中起关键作用。由于miR172的过表达对AP2L1和AP2L5的转录调控没有显著影响（S3图），我们认为VRN1对miR172的上调（图5J）不足以解释VRN1对AP2L1的转录下调（图5K）。
在冬小麦中，春化导致VRN1及其最接近的副因子FUL2和FUL3的表达诱导（图6和S9G-S9I）。即使在没有春化的情况下，这三个基因也在较老的冬季植物中被诱导（图5，S9D和S9E），并且它们的诱导时间与AP2L1和AP2L5的下调（图5F和S9C）相吻合，为VRN1在叶片中AP2L基因直接或间接下调中的作用提供了额外的支持。
我们推测，AP2Ls在后期发育阶段的下调可能反映了这些基因对节间伸长的额外作用。与非转基因对照相比，表达MIM172的转基因小麦植株具有更高的AP2Ls表达和较短的节间[66]。同样，大麦中AP2L2的miR172靶位点的显性突变对生殖过渡期间的花梗伸长呈负调节[95]。由于旗叶中AP2Ls的下调与FT1表达的增加有关（图5），并且FT1是促进小麦节间伸长所必需的[92]，我们推测AP2Ls可以通过控制叶片中的FT1表达来控制节间伸长。
miR156通过控制miR172和其他基因来调节开花
在拟南芥中，miR156对多个SPL基因的表达进行负调节，直接促进miR172表达的诱导和生殖阶段的启动[65，78，96–98]。此外，SPL转录因子还可以通过miR172非依赖性途径调节开花。例如，拟南芥SPL3、SPL9和SPL15促进SOC1、FUL、AP1和LFY在SAM中的表达[96，98，99]，这些相互作用与非感性SD条件下的开花促进有关。
在小麦中，miR156的过表达也导致几个SPL基因的抑制[88]，这表明miR156-SPL模块在小麦中是保守的。在转基因小麦植物（包括MIM156和MIM172）中观察到的明显更早的开花相对于仅包括MIM172的植物（S7图）表明miR156也可以通过miR172非依赖性途径调节开花时间。我们的数据表明，除了miR172之外，FUL2和FUL3还可能参与miR156-SPL模块下游的开花响应。在晚开花植物的成虫叶片中，miR156过度表达，FUL2和FUL3表达降低（图3H和3I），类似于miR172。此外，在非春化冬季植物的叶子中，FUL2和FUL3的表达比FT1和VRN-B1（W14，图5B和5C）早几周（W12，S9D和S9E Fig）。
在Kronos中使用玉米泛素促进剂对FUL2的过表达导致加速开花[100];因此，测试SPL转录因子是否通过诱导FUL2和FUL3表达促进非春化冬季植物的开花将是很有趣的。
将 miR172-AP2L 调节模块集成到小麦开花网络中
开花时间必须在最佳时间发生，以最大限度地提高繁殖成功率。这种精确度是通过一个复杂的调节网络实现的，该网络感知，翻译并将不同的信号整合到一些中心开花基因的调节中。在小麦中，开花通过长日和春化促进，两种途径都汇聚在叶子中FT1的激活上（图8）。我们将保守的miR156-miR172-AP2L模块纳入该模型，该模块构成了调节叶片中FT1表达的另一种途径（图8）。
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图 8. 小麦开花调控工作模型.
(A）开花网络将光周期、春化和年龄信号整合到小麦叶片FT1表达的调控中。箭头表示基因表达的促进和以交叉条抑制结束的谱系。括号中的数字表示支持不同相互作用的参考文献（红色表示拟南芥参考文献）。支持本文中介绍的相互作用的关键数字以蓝色表示。（B）模型，说明miR172和AP2L1在植物发育中的表达谱。上图显示了miR172和AP2L1在春小麦品种中的表达谱，其中VRN1在没有寒冷的情况下表达。中间面板显示了miR172和AP2L1在冬小麦背景中没有春化（冬季-NV）的表达谱。下图显示了春化冬季植物（冬季-春化）的表达特征。在此背景下，春化后的VRN1表达（浅蓝色区域）促进miR172上调和AP2L1下调。在春季和冬季品种中，叶片中的miR156表达随着植物年龄而下调。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.g008
在这个模型中，VRN2和AP2Ls都抑制了叶子中的FT1，以防止秋季开花。在春季品种中，miR156和miR172的序贯作用对AP2L基因水平的发育水平进行了下调，从而促进了春季品种的快速开花过渡。然而，在冬小麦植株中，miR172的上调和AP2L基因的下调需要在春化过程中诱导VRN1，这导致额外的调节层，延迟FT1的上调并防止秋季过早开花。反过来，AP2Ls的剂量或抑制活性的变化会影响冬小麦背景的开花时间。在亚饱和条件下，AP2L剂量或活性较低的植物需要较少的VRN1和较低的VRN2表达减少（较少的冷）来诱导FT1表达。
综上所述，我们的结果表明，保守的开花基因和温带草特异性基因在整合植物年龄，春化和光周期的网络中高度相互关联，以介导及时的开花响应（图8）。我们的研究结果还表明，随着冬季因气候变化而变得更加温和，调节AP2L剂量或活性可能是调节冬季品种开花响应的宝贵工具。
材料和方法
植物材料和生长条件
本研究中使用的四倍体小麦品种Kronos具有由Vrn-A1c等位基因（内含子1缺失）决定的春季生长习性，以及由Ppd-A1a等位基因（启动子缺失）赋予的光周期响应降低。Kronos还具有AP2L-5A Q等位基因，该等位基因赋予亚紧凑的刺突表型和自由脱粒性，以及一个非功能性AP2L-5B基因[66]。用甲磺酸乙酯（EMS）[101]诱变的Kronos和Cadenza（六倍体）的耕作种群用于筛选AP2L1中的突变体。AP2L1同源体中两个选定的截断突变和AP2L-A1中miR172靶位点的突变在M中得到证实4谷物使用S3表中描述的基因组特异性引物。
突变体M4在表型分析之前，植物与亲本野生型Kronos杂交至少两次，以减少突变背景。突变CAD161在六倍体小麦Cadenza中被鉴定出来。由于 Kronos x Cadenza 杂交导致杂交坏死，因此我们在 CAD161 突变体和 F 之间使用了桥梁杂交2植物从六倍体线Insignia和四倍体Kronos之间的杂交。然后我们回溯了F1到克洛诺斯两次。
vrn-a1和vrn1-null系[41]，以及ap2l5突变品系K3946 [66]之前已经描述过了。对于所有实验，首先在4°C下将谷物冷吸收2-4天，然后再将其转移到室温下。将植物在PGR15生长室（Conviron）的一加仑花盆中生长，调节到16小时的光照（22°C）和8小时的黑暗（18°C）（长日条件或LD）或8小时的光照（22°C）和16小时的黑暗（18°C）（短日条件或SD）。在植物高度测量的卤化钠灯的强度为（~260-300μM m-2s-1).
在第二叶阶段的植物在一加仑的花盆中在冷室（Conviron）中春化，温度平均为5°C，日长设置为16小时的光照/ 8小时的黑暗。在植物高度的光相期间，光的强度为230μM m-2s-1.在不同的实验中使用不同长度的春化处理：在图5G-5K和S9F-S9I中，植物春化8周;在图6A和6B中，植物春化2，3和6周;在图6C-6H中，植物春化3周和6周;在S10 Fig中，植物春化2周;在S11 Fig中，植物春化4周。
qRT-PCR
在所有实验中，我们在主舵柄中收集了最后一片完全膨胀的叶子，并在灯打开4小时后收获样品，除了图6，其中叶子是在光周期（ZT8）的中间收获的。使用光谱植物总RNA试剂盒（Sigma-Aldrich）提取RNA样品。我们遵循协议A，允许纯化包括小RNA分子在内的总RNA。总RNA用RQ1无RNase DNase（Promega）处理。cDNA合成使用SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）进行。从1μg总RNA开始，使用OligodTv引物对mRNA进行反向转录。成熟的miR172和miR156水平通过茎环qRT-PCR测定，如前所述[102]，成熟miR156和miR172的特异性茎环寡核苷酸在S3表中描述。小核仁RNA 101（snoR101）的反向引物也包含在逆转录中，该引物是用于在qRT-PCR中使miRNA正常化的参考。如图6和图7中春化时间过程实验的RNA提取和cDNA合成如[44]所述。该产品从1圣将链合成稀释1/20，并将5μl稀释的cDNA用于qRT-PCR反应。使用SYBR Green和7500快速实时荧光定量PCR系统（应用生物系统）进行定量PCR。ACTIN基因用作mRNA的内源性对照，SnoR101用于miRNA。S3表中列出了所测试的不同基因的引物。
向量
使用S3表中的引物从Kronos cDNA扩增AP2L-B1基因的编码区域，并将其克隆到pENTR载体（Invitrogen）中。然后将其亚信子亚型化到玉米泛素启动子（UBI）下游的pLC41载体中。专业版）带有 C 端子 HA 标签（从此称为 UBI专业版：AP2L-B1）。为了生成miR156过表达谱系，使用S3表中的引物通过Kronos基因组DNA的PCR扩增miR156b，c位点（B基因组）。将PCR产物克隆到pDONR（Invitrogen）中，然后亚克隆到UBI下游的pLC41中。专业版.自UBI以来专业版：miR156b，c植株为无菌，在小麦中开发了LhG4/pOp双组分系统，以保持miR156过表达线的稳定。LhG4是一种合成转录因子，与合成的pOp启动子结合并激活转录[89]。将LhG4编码序列克隆到玉米UBI下游的pLC41载体中专业版生成驱动程序向量 （UBI专业版：LhG4）。全民用品专业版（UBI）专业版：miR156b，c 向量被 pOp 替换以生成响应器向量 （pOp：miR156）。最后，UBI专业版以LhG4和pOp：miR156为交系，在F组进行表型和分子分析1植物。
为了生成人工MIM156，合成了拟南芥[103]中描述的天然miR399靶标模拟IPS1基因的小麦同源物，并将与miR399互补的序列替换为与miR156互补的序列。MIM156的完整序列在S11图中提供。MIM156结构被克隆到玉米UBI下游的二元载体pLC41中。专业版.MIM172 和 UBI 线路专业版：miR172在[66]之前被描述过。
小麦转化
转基因小麦植物是在加州大学戴维斯分校植物转化设施（http://ucdptf.ucdavis.edu/）使用加州大学戴维斯分校授权的日本烟草（JT）技术生产的。来自Kronos的未成熟胚胎使用农杆菌EHA105进行转化。使用潮霉素进行转基因植物的选择，并通过DNA提取和PCR验证转基因插入。
统计分析
本研究中提供的所有图形和表的原始数据和描述性统计量在 S1 数据文件中提供。均值比较是使用Tukey测试完成的，该测试相互比较所有均值。在包括野生型（Wt）对照在内的实验中，还进行了Dunnett测试，并将其包含在S1数据中，以提供与Wt差异的显着性的更精确估计。在所有统计比较中，首先测试了使用Levene检验的方差同质性和使用夏皮罗-威尔克检验的残差正态性。如果数据不符合方差分析 （ANOVA） 的假设，则使用功效变换来恢复它们。当功率变换不能同时满足这两个假设时，使用非参数Kruskal-Wallis检验。所有统计分析均使用 SAS 版本 9.4 执行。
使用Excel生成以箱形图呈现的数据的分布，包括单个数据点。框的中线表示中位数，x 表示平均值。框的底线表示第一个四分位数，顶线表示第三个四分位数。晶须从盒子的末端延伸到最小值和最大值。
支持信息
CS参考文献中AP2L基因的基因ID v1.1。
显示 1/15： pgen.1010157.s001.xlsx
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一个 B C D E F G
1 表 S1.小麦AP2L基因CS参考文献seq. v1.1中的基因ID
2
3 AP2L1 AP2L-A1 TRAESCS1A02G058400 AP2L-B1 TraesCS1B02G076300 AP2L-D1 TRAESCS1D02G059200
4 AP2L2 AP2L-A2 TRAESCS2A02G514200 AP2L-B2 TRAESCS2B02G542400 AP2L-D2 TRAESCS2D02G515800
5 AP2L5 AP2L-A5 TRAESCS5A02G473800 AP2L-B5 TRAESCS5B02G486900 AP2L-D5 TRAESCS5D02G486600
6 AP2L7 AP2L-A7 变速器CS7A02G744600LC AP2L-B7 变速器CS7B02G440400 AP2L-D7 公司CS7D02G512600
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表 S1
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无花果
S1 表。 CS参考文献中AP2L基因的基因ID v1.1。
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S2 表。 miR156小麦位点。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s002
（XLSX）
S3 表。 本研究中使用的引物。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s003
（XLSX）
S1 图 克罗诺斯野生型开花，UBI专业版：sD 条件下的 miR172 和 MIM172 线路。
(A） 九周龄的 UBI专业版：miR172，野生型克罗诺斯（Wt）和MIM172植物，生长在SD下。比例尺= 10厘米。（B-C）箱形图显示到标题的天数（B;n ≥7）和UBI中主舵柄产生的叶子数量（C;n≥9）专业版：miR172，野生型克罗诺斯（Wt）和MIM172植物在SD下生长.（D-G）箱形图显示了通过qRT-PCR测定的VRN1（D），FT1（E），VRN2（F）和PPD1（G）的表达水平第三（L3） 和 6千（L6） UBI的叶子专业版：miR172，野生型Kronos（Wt）和MIM172植物在SD下生长。数据对应于四个独立的生物重复。箱形图上方的不同字母表示基于Tukey检验的显着差异（P <0.05）。S1 数据中数据 H 中的原始数据和统计测试。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s004
（TIF）
S2 图 ap2l1和ap2l5突变体的尖峰表型。
(A）来自野生型克罗诺斯（Wt），ap2l1，ap2l5和ap2l1 ap2l5植物的主要穗和（B）中央小穗。 ap2l5 和 ap2l1 ap2l5 小点中的红色星号表示第一个空引理。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s005
（TIF）
S3 图 UBI中AP2L1和AP2L5的表达水平专业版：miR172，野生型和MIM172植物。
(A-B）显示 5 中 AP2L1 （A） 和 AP2L5 （B） 表达水平的箱形图千UBI的叶子专业版：miR172，野生型克罗诺斯（Wt）和MIM172植物在LD下生长（与图1B中用于量化miR172表达的生物样品相同）。转录本水平通过qRT-PCR测定，使用ACTIN作为内部参考。数据对应于四个独立的生物重复。箱形图上方的不同字母表示基于Tukey检验的显着差异（P <0.05）。S1 数据中数据 I 中的原始数据和统计测试。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s006
（TIF）
S4 图 UBI 中 FUL2 和 FUL3 的表达水平专业版：miR172，野生型和MIM172植物。
(A-B）1. 通过 qRT-PCR 测定的 FUL2 （A） 和 FUL3 （B） 的表达水平圣（L1）， 3第三（L3）， 5千（L5） 和 7千（L7） UBI的叶子专业版：miR172，野生型Kronos（Wt）和MIM172植物在LD下生长。数据对应于四个独立的生物重复。基于Tukey检验，每片叶子数据点上方的不同字母表示显着差异（P <0.05）。字母的颜色对应于基因型的颜色。S1 数据中数据 J 中的原始数据和统计测试。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s007
（TIF）
S5 图 VRN1、VRN2 和 FT1 在 5 中的表达水平千MIM172和UBI分离的植物叶专业版：AP2L-B1.
(A-C）箱形图显示了由qRT-PCR测定的VRN1（A），FT1（B）和VRN2（C）的表达水平，在5千F的叶子2工厂为 UBI 隔离专业版：在LD下生长的AP2L-B1和MIM172转基因，以ACTIN为内参。数据对应于四个独立的生物重复。箱形图上方的不同字母表示基于Tukey检验的显着差异（P <0.05）。S1 数据中数据 K 中的原始数据和统计测试。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s008
（TIF）
S6 图 克罗诺斯miR156b，c位点的过表达.
(A）显示包括玉米泛素启动子（UBI）在内的盒的方案专业版）以及与miR156b，c（B基因组）位点相对应的序列。miR156b，c序列的预测二级结构如下所示。请注意三个阀杆环结构，包括三个 miR156/miR156* 双工，对应于三个 miR156 前体串联。（B）野生型克罗诺斯植物（Wt，左）和四个独立的转基因T0品系表达UBI专业版：miR156b，c 生长在 LD 下，比例尺 = 10 厘米。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s009
（TIF）
S7 图 野生型开花表型，MIM156，MIM172和MIM156 MIM172植物。
(A-B）箱形图显示了在LD条件下生长的野生型Kronos（Wt），MIM156，MIM172和MIM156 MIM172植物在过渡到穗柄（B;n ≥10）之前，标题天数（A; n ≥9）和主舵柄产生的叶子数量。箱形图上方的不同字母表示成对Kruskal-Wallis检验中的显着差异（P≤0.05）。S1 数据中数据 L 中的原始数据和统计测试。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s010
（TIF）
S8 图 冬季克洛诺斯对不同长度的春化处理的开花反应.
(A-B）箱形图显示了在LD条件下生长的无春化（NV）的冬季Kronos（vrn-A1）植物在过渡到穗（B）之前主舵柄产生的天数（A）和主舵柄产生的叶子数量，具有2周（2WV），4（4WV），6（6WV）和8（8WV）周的春化。箱形图上的不同字母表明，在P<0.05时，Kruskal-Wallis非参数成对检验存在显著差异。S1 数据中数据 M 中的原始数据和统计测试。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s011
（TIF）
S9 图 春化和VRN1表达对春冬品种开花基因转录水平的影响
(A）六周龄的春季和冬季Kronos植物在LD条件下生长，没有春化。比例尺 = 10 cm. （B） 箱形图显示春季和冬季 Kronos 植物在 LD 条件下生长的天数，无需春化（t 检验，n ≥ 6）。（C-E）在没有春化处理的情况下，在LD条件下生长的春冬季克罗诺斯植物中，qRT-PCR测定的AP2L5（C），FUL2（D）和FUL3（E）表达水平的时间过程。W1 = 第 1 周，1圣叶;W5 = 第 5 周，第 7 周千叶;W10 = 第 10 周，第 10 周千-11千;W12 = 第 12 周，第 13 周千-14千;W14 = 第 14 周，第 15 周千-16千;W16 = 第 16 周，第 18 周千-19千;W18，第18周，旗帜叶（20千-23第三).ACTIN被用作内部参考。数据对应于四个独立的生物重复。* = P ≤ 0.05 在 t 检验中比较春季与冬季植物同一片叶的表达，但使用非参数 Kruskal-Wallis 检验的面板 （E） 除外。（F-I）箱形图显示了由qRT-PCR测定的AP2L5（F），VRN-B1（G），FUL2（H）和FUL3（I）在7中的表达千（L7）冬季克洛诺斯的叶子没有春化，和7千冬季克洛诺斯和vrn1-null突变体的叶子春化8周，然后移动到室温两周。来自 7 的样品千当叶子完全膨胀时，叶子被收集。ACTIN被用作内部参考。数据对应于至少5个独立的生物重复。（F）相同的字母表明在Tukey测试中缺乏显着差异。（H）未检测到非春化冬季克洛诺斯和vrn1-null样品的FUL2表达，因此没有进行统计学检验。（G和I）未检测到非春化冬季Kronos样品的VRN-B1和FUL3表达，因此对其他两个样品进行了t检验（*** = P <0.001）。S1 数据中数据 N 中的原始数据和统计测试。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s012
（TIF）
S10 图 MIM172 UBI的开花响应专业版：春化4周后的AP2L-B1冬季植物。
（A-B）箱形图显示了在LD条件下生长的植物中主舵柄（B）的天数（A）和主分蘖产生的叶子数量，春化时间为4周。vrn1-null = 无功能性 VRN1 基因，冬季 Kronos，冬季线与 MIM172 转基因，冬季线与 MIM172 和 UBI专业版：AP2L-B1 转基因箱形图上方的不同字母表示Tukey检验中存在显著差异（P<0.05）。S1 数据中数据 O 中的原始数据和统计测试。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s013
（TIF）
S11 图 MIM156 序列。
与 miR156 互补的序列为红色。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s014
（TIF）
S1 数据。 Excel 文件（电子表格 A 到 O），包括支持数字和补充数字的数据和统计分析。
S1 数据中的数据 A。图 1 的支持数据。S1 数据中的数据 B。图 2 的支持数据。S1 数据中的数据 C。图 3 的支持数据。S1 数据中的数据 D。图 4 的支持数据。S1 数据中的数据 E。图 5 的支持数据。S1 数据中的数据 F。图 6 的支持数据。S1 数据中的数据 G。图 7 的支持数据。S1 数据中的数据 H。S1 的支持数据图S1 数据中的数据 I。S3 的支持数据图S1 数据中的数据 J。S4 的支持数据图S1 数据中的数据 K。S5 的支持数据 图S1 数据中的数据 L。S7 的支持数据 图S1 数据中的数据 M。S8 的支持数据图S1 数据中的数据 N。S9 的支持数据 图S1 数据中的数据 O。S10 的支持数据图
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010157.s015
（XLSX）
确认
我们感谢Mariana Padilla和Xiaoqin Zhang的出色技术支持。我们感谢David Jackson博士为载体提供LhG4和pOp序列。
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